Summary

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

Published: January 31, 2012
doi:

Summary

Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Abstract

O mouse é um organismo excelente modelo para estudar o desenvolvimento do cérebro dos mamíferos, devido à abundância de dados moleculares e genéticos. No entanto, o cérebro do rato em desenvolvimento não é adequado para fácil manipulação e de imagem in vivo desde o embrião de rato é inacessível e opaco. Culturas fatia organotípicas de cérebros embrionárias são, portanto, amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento do cérebro de camundongos in vitro. Ex-vivo de manipulação ou o uso de camundongos transgênicos permite a modificação da expressão do gene para que subpopulações de células neuronais ou gliais podem ser rotulados com proteínas fluorescentes. O comportamento de células marcadas podem então ser observadas utilizando lapso de tempo de imagem. Lapso de tempo de imagem tem sido particularmente bem sucedido para estudar comportamentos de células que sustentam o desenvolvimento do córtex cerebral na tarde estágios embrionários 1-2. Embrionárias sistemas fatia organotípicas cultura em regiões do cérebro fora da parte frontal do cérebro são Establis menos bemhed. Portanto, a riqueza de dados time-lapse imagem descrevendo a migração celular neuronal é restrito a parte frontal do cérebro 3,4. Ainda não é conhecido, se os princípios descobertos para o cérebro dorsal são verdadeiras para áreas do cérebro ventral. Ventral do cérebro, os neurônios são organizados em grupos neuronal ao invés de camadas e muitas vezes eles têm que se submeter complicadas trajetórias migratórias para chegar a sua posição final. Mesencéfalo ventral não é apenas um sistema bom modelo para o desenvolvimento cerebral ventral, mas também contém populações neuronais tais como neurônios dopaminérgicos que são relevantes nos processos de doença. Enquanto a função e degeneração de neurônios dopaminérgicos tem sido investigada em grande detalhe no adulto e envelhecimento cerebral, pouco se sabe sobre o comportamento desses neurônios durante a sua diferenciação e fase de migração, 5. Descrevemos aqui a geração de culturas fatia do dia embrionário (E) do mesencéfalo ventral de rato 12,5. Estes cult fatiamentos são potencialmente adequado para o monitoramento do desenvolvimento dos neurônios dopaminérgicos durante vários dias in vitro. Destacam-se os passos críticos na geração de fatias do cérebro nesses estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e discutir as condições necessárias para manter o desenvolvimento normal de neurônios dopaminérgicos in vitro. Também apresentam resultados de experimentos de tempo de imagem lapso. Nesses experimentos, mesencéfalo ventral de precursores (incluindo precursores dopaminérgicos) e seus descendentes foram rotulados de uma forma de mosaico usando um Cre / loxP baseada induzível sistema de mapeamento destino 6.

Protocol

Partes do presente protocolo são modificados a partir de Daza et al., 2007 7. 1. Preparativos Pode ser preparado um dia de antecedência Prepare 1X tampão Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO 3; ajustar o pH para 7,4. Filtro de esterilizar (0,22 tamanho dos poros mm) e armazenar …

Discussion

O método de cultura organotípicas fatia aqui apresentada fornece um sistema para o curto prazo in vitro de análise de desenvolvimento de neurônios dopaminérgicos e suas rotas migratórias e projeção no mesencéfalo ventral embrionárias. Descobrimos que há uma série de etapas críticas do protocolo que deve ser cuidadosamente atendidos, a fim de obter fatias que permitem o desenvolvimento normal dos neurônios do mesencéfalo ventral dopaminérgicos. O passo mais crítico é a dissecação do cérebro …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Martine Emond e Isabel Brachmann por sua ajuda no estabelecimento do sistema de cultura organotípicas fatia e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Frank Costantini para o R26 ratos repórter e Cliff Tabin para os ratos creer Shh. Este estudo foi financiado por um Prêmio de Pesquisa do Ministério da Ciência e Investigação de North-Rhine Westphalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Materials

Table of specific reagents and equipment

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
DMEM Sigma-Aldrich D6429  
Glucose 30% Sigma-Aldrich G7528-250  
Horse Serum Invitrogen 26050-088  
DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) Sigma-Aldrich D6429-500  
Penicillin/Streptomycin 100x Sigma-Aldrich P4333-20  
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 prepare 200mM stock and store at -20°C
UltraPure LMP agarose Invitrogen 15517-022  
Millicel inserts Millipore PICMORG50  
μ-dish 35 mm, low Ibidi 80136  
Vibratome Microm HM 650V  
Razor Blade Plano GmbH 121-6  
Histoacryl  glue BRAU9381104 Braun Aesculap  
Perforated Spoon Dia
diameter 15 mm
Fine Science Tools 10370 -18
Forceps 5 Dumoxel Fine Science Tools 11252 – 30  

Antibodies used for immunostainings:

Name of the antibody Company Catalogue number Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase Millipore AB152 Dilution 1:500
Mouse anti-tyrosine hydroxylase Millipore MAB318 Dilution 1:500
Mouse anti-BrdU BD Pharmingen 555627 Dilution 1:200
Rabbit anti-cleaved caspase 3 Cell Signaling Technology 9661 Dilution 1:200
Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 Invitrogen A21206 Dilution 1:500
Donkey anti-mouse IgG-Cy3 Jackson ImmunoResearch 715-165-150 Dilution 1:200

References

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  2. Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
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Cite This Article
Bodea, G. O., Blaess, S. Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro. J. Vis. Exp. (59), e3350, doi:10.3791/3350 (2012).

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