Summary
يوصف أسلوب لتوليد شرائح عضوي النمط من الدماغ المتوسط E12.5 الفئران الجنينية. يمكن استخدام شريحة عضوي النمط الثقافات لمراقبة سلوك الخلايا العصبية الدوبامين العصبية الدماغ المتوسط أو غيرها من بطني.
Abstract
الفأر هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة تطور الدماغ لدى الثدييات بسبب وفرة من البيانات الجزيئية والجينية. ومع ذلك ، فإن مخ الفأر النامية ليست مناسبة للتلاعب السهل والتصوير في الجسم الحي منذ جنين الفأر لا يمكن الوصول إليها وغير شفافة. ولذلك فإن الثقافات شريحة عضوي النمط من العقول الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تطور الدماغ الفئران في المختبر. السابقين فيفو تلاعب أو استخدام الفئران المعدلة وراثيا يسمح تعديل الجينات بحيث يمكن تسمية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية أو الدبقية مع البروتينات الفلورية. ويمكن بعد ذلك على سلوك الخلايا المسمى يراعى استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. وقد الوقت الفاصل بين التصوير ناجحة بشكل خاص لدراسة سلوك الخلية التي تكمن وراء تطور قشرة الدماغ في المراحل الجنينية في وقت متأخر 1-2. الجنينية ثقافة شريحة عضوي النمط النظم في مناطق الدماغ خارج الدماغ المقدم establis هي أقلهد]. لذلك ، يقتصر ثروة من البيانات التصوير الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية التي تصف هجرة الخلية إلى 3،4 الدماغ المقدم. ما زال من غير المعروف ما إذا كانت المبادئ اكتشفت للدماغ الظهرية ينطبق على مناطق الدماغ البطني. في الدماغ البطني ، ويتم تنظيم الخلايا العصبية في مجموعات الخلايا العصبية بدلا من الطبقات وغالبا ما يتعين عليها الخضوع لمسارات معقدة للوصول إلى المهاجرة موقفهم النهائي. الدماغ المتوسط في بطني ليست مجرد نظام نموذجا جيدا للتطور الدماغ البطني ، ولكن أيضا على السكان العصبية مثل الدوبامين العصبية التي هي ذات الصلة في عمليات المرض. في حين تم التحقيق فيها وظيفة وتنكس الخلايا العصبية الدوبامين بتفصيل كبير في تعليم الكبار والمخ من الشيخوخة ، لا يعرف إلا القليل عن سلوك هذه الخلايا العصبية خلال مرحلة التمايز والهجرة 5. نحن هنا وصف الجيل الثقافات شريحة من اليوم الجنينية (E) الدماغ المتوسط 12.5 الماوس البطني. هذه شريحة عبادةures ويحتمل أن تكون مناسبة لرصد الخلايا العصبية الدوبامين التنمية على مدى عدة ايام في المختبر. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة في توليد شرائح الدماغ في هذه المراحل المبكرة من التطور الجنيني ، ومناقشة الشروط اللازمة للحفاظ على النمو الطبيعي للخلايا العصبية الدوبامين في المختبر. نحن أيضا نتائج التجارب الوقت الحاضر من التصوير الفاصل. في هذه التجارب ، وصفت السلائف بطني الدماغ المتوسط (بما في ذلك السلائف الدوبامين) وذريتهم بطريقة الفسيفساء باستخدام لجنة المساواة العرقية / loxP مصير محرض نظام يستند تعيين 6.
Protocol
يتم تعديل أجزاء من هذا البروتوكول من دازا وآخرون ، 2007 7.
1. الاستعدادات
- يمكن أن يكون مستعدا قبل يوم واحد
- إعداد 1X كريبس العازلة (1.5 لتر) : كلوريد الصوديوم 126 ملم ، 2.5 ملم بوكل ، 1.2 ملي ناه 2 ص 4 : H 2 O ، 1.2 ملي MgCl 2 ، 2.5 مم CaCl 2 و 11 الجلوكوز مم ، 25 مم NaHCO 3 ؛ ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. فلتر تعقيم (0.22 ميكرون حجم المسام) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تحضير مستنبت (20 مل) : 5 مل HBSS ، 9 مل DMEM الجلوكوز المرتفعة ، 850 ميكروليتر من الجلوكوز 30 ٪ ، 5 مل حصان المصل (25 ٪). إضافة 200 100X Penicllin ميكرولتر / الستبرتوميسين. تخزين عند 4 درجات مئوية.
- قبل البدء في إعداد تشريح
- تحضير 100 مل من 4 ٪ agarose انصهار منخفضة (LMP agarose) في 1X كريبس العازلة : الميكروويف الحل حتى يذوب تماما agarose ثم ضع agarose في حمام الماء 45 درجة مئوية.
- تملأ فاتتومي العازلة مع علبة الجليد الباردة العازلة كريبس 1X وبدء عنصر التبريد (الحفاظ على درجة مئوية 4). الإصلاح شفرة حلاقة في الحامل النصل وانشاء منطقة vibratome مع الفرشاة مشرط ، ودفع غرامة وملعقة صغيرة مثقبة لالتقاط الشرائح. تحضير أطباق بتري معقمة (35 × 10 ملم) مع المخزن كريبس 1X لجمع القطع. تبقي على الجليد.
- انشاء منطقة تشريح مع أطباق بتري معقمة (100 × 15 ملم) للتشريح وأصغر العقيمة أطباق بتري (35 × 10 ملم) من أجل التضمين ، مقص صغير ، وهما ملقط غرامة (دومون 5) ، وملعقة صغيرة مثقوبة ، والزجاج مغلق ماصة باستير النار مصقول مع جولة الحافة و 1 لتر من العازلة كريبس 1X على الجليد. مسح جميع الأدوات تشريح مع الايثانول 70 ٪.
- إضافة مستنبت للآبار لوحة ستة جيدا (1.5 مل / جيد) ووضعه في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- إعداد لوحة لمدة ستة جيدا مع 1.5 مل / معقمة جيدا 1X العازلة كريبس و 15 ميكرولتر Penicilin / الستبرتوميسين (100X) بشكل جيد /. تحت ظروف معقمة ، ومكان ميلإدراج الثقافة licell خلية في الآبار. مكان لوحة ستة جيدا بجانب vibratome بحيث يمكن نقل شرائح الدماغ على الأغشية مباشرة بعد تصفية sectioning.
2. تشريح أدمغة وتضمينها الجنينية
- تخدير ماوس الإناث الحوامل isoflurane باستخدام الماوس والتضحية من قبل خلع عنق الرحم (الأجنة ينبغي أن تكون في مرحلة E12.5). تشريح خارج الرحم من الفأرة عن طريق سحب ما يصل الرحم بالملقط. استخدام ملقط أخرى لفصل mesometrium بعيدا عن الرحم. مكان الرحم في الجليد الباردة العازلة كريبس 1X. استخدام ملقط غرامة لفصل الجدار العضلي للرحم ، غشاء رايخرت والحشوية الكيس المحي من الجنين. إزالة الأجنة من الرحم. وضع الأجنة في تشريح طبق بتري معقمة عازلة منفصلة مع كريبس 1X.
- تشريح الدماغ تحت stereomicroscope. لتشريح الدماغ ، وأول خفض قبالة رأس الجنين. رئيس إصلاحثقب بواسطة ملقط غرامة من خلال رئيس (مستوى العين). استخدام زوج آخر من الملقط لإزالة بعناية الجلد والجمجمة. استخدام ملقط لرفع بعناية خارج الدماغ وتحويلها إلى طبق بتري معقمة العازلة مع كريبس 1X. من المهم جدا أن يتم الحفاظ على سلامة الدماغ خلال تشريح كامل ، لأن الأضرار التي لحقت نسيج المخ سيخلق المشاكل (مثل تمزيق النسيج) خلال sectioning على vibratome.
- غسل أدمغة مرة واحدة في نقطة انصهار منخفضة 4 ٪ (LMP) agarose. تضمين 2-3 العقول في وقت الطازجة agarose LMP 4 ٪. ضع الأطباق التضمين على الجليد حتى ممكن. استخدام ماصة باستير مع طرف النار مصقولة مستديرة لرفع العقول حتى توطد الجزء السفلي من agarose. يجب أن يستقر في العقول المسطحة موقف الأفقي إلى أسفل كتلة agarose.
- بعد agarose وقد عززت بالكامل (بعد حوالي 3 دقائق) ، تقليم agarose المحيطة العقول والغراء كتلة agarose على خشبة المسرح عينةمن vibratome. عند لصق القطع ، تأكد من أن الجانب البطنية من الدماغ هو مواز للمنصة ، حيث ينبغي خفض العقول في طائرة الفرع الأفقي.
3. Vibratome sectioning
- استخدام شفرة حلاقة لsectioning. للحصول على شرائح سليمة من المهم جدا للحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية خلال sectioning.
- القسم 300 ميكرون سميكة شرائح أفقية على تردد 50 هرتز ، شفرة سعة 1.1 ملم وتصل سرعتها من 25 مم / ثانية.
- استخدام الفرشاة لدفع غرامة شريحة في ملعقة صغيرة مثقبة لجمع شرائح الدماغ ونقلها إلى الطبق مع العقيمة الجليد الباردة العازلة كريبس 1X. اختيار شريحة تحتوي على أنسجة المخ الأوسط بطني (انظر الشكل 1). في مخ الفأر E12.5 هناك شريحة واحدة فقط 300 ميكرون الأفقي الذي يحتوي على أنسجة المخ الأوسط بما في ذلك بطني الخلايا العصبية الدوبامين.
4. شريحة الثقافة
وينبغي القيام بالخطوات 4،2-4،5 في ظل ظروف معقمة.
- نقل شرائح الدماغ على ادخال ثقافة غشاء الخلية Millicell في صفيحة ستة جيدا مع 1X كريبس العازلة (انظر النقطة 1.2.5). لنقل شريحة استخدام الملعقة صغيرة مثقبة (أدوات العلوم الجميلة) والفرشاة بشكل جيد. يمكن وضع ما يصل إلى 3 شرائح على أحد الغشاء.
- نقل الغشاء مع شريحة لوحة ستة جيدا مع الثقافة المتوسطة (انظر النقطة 1.2.5). لا ينبغي أن الجزء العلوي من الغشاء تكون مشمولة المتوسط. الشريحة المتوسطة من الدماغ يستقبل أدناه والهواء من فوق.
- مكان لوحة ستة جيدا في الحاضنة مع 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. من المهم جدا أن يتم وضع شرائح في الحاضنة في غضون 2 ساعة بعد الخطوة الاولى للتشريح. ويمكن لمزيد من الوقت اللازم لإعداد تمديد النتيجة في بقاء الفقراء من الشرائح.
- لا يمكن الحفاظ عليه في المختبر شرائح تصل إلى 3 أيام. تغيير 50 ٪ من مستنبت في اليوم الثاني 2.
ق = "jove_title"> 5. الوقت الفاصل بين التصوير
- السماح للشرائح في استرداد حاضنة لل4-5 قبل ساعات من بدء الوقت الفاصل بين التصوير.
- عن الوقت الفاصل بين التصوير ، والحفاظ على شرائح على إدراج الغشاء ونقل إدراج الى 35 μ صحن Ibidi ملم (الجزء السفلي من الطبق يتكون من مواد ذات جودة عالية البصرية).
- إضافة 1 مل من مستنبت زائد 1.5 ميكرولتر حمض الاسكوربيك (200 ملم) على طبق. حمض الاسكوربيك يحمي ضد شرائح الضيائية.
- احتضان شرائح في غرفة البيئية عند 37 درجة مئوية مع CO2 5 ٪ خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
6. ممثل النتائج
الشكل 1 يوضح إعداد الثقافات شريحة عضوي النمط من مخ الفأر E12.5. ويبين الشكل 2 شرائح عضوي النمط الأفقي (الحادة وبعد عدة أيام في الثقافة) التي تم الحصول عليها شكل الماوس E12.5 الدماغ. وعلى سبيل المقارنة ، أقسام الدماغ المجمدة في المراحل التنموية يعادلوترد. عصبونات الدماغ المتوسط الدوبامين هي تصور مع المناعية لهيدروكسيلاز التيروزين (TH). الدماغ المتوسط الدوبامين العصبية المشروع إلى أهداف في الدماغ المقدم. هذه التوقعات في بداية لتشكيل E12.5 وتمتد نحو الدماغ المقدم خلال الأيام اللاحقة. علينا النظر في وضع إسقاطات الدماغ المقدم باعتباره مؤشرا جيدا للتطور الطبيعي للخلايا العصبية الدوبامين في الثقافة. في الدماغ المتوسط الدوبامين العصبية شرائح أفقية تمتد نحو التوقعات بشكل سليم الدماغ المقدم المنطقة المستهدفة. بعد 3 DIV (أيام في المختبر) أو عند تلف الدماغ المقدم المناطق المستهدفة ، والإسقاطات شاذة تمتد نحو الدماغ المتوسط الظهرية. وترد أمثلة على شرائح من الاكليلية E12.5 الدماغ المتوسط في الشكل 3. تصور الخلايا العصبية الدوبامين مع immunostaining TH لتمديد إسقاطات الشاذة في الدماغ المتوسط الظهرية. ويبين الشكل 4 تحليل المتكاثرة ، الخلايا نخرية وأفكارك في ثقافات شريحة عضوي النمط. BrdU ايمmunostaining لتصور الخلايا المتكاثرة يدل على أن الخلايا تتكاثر في ظروف الثقافة بعد 1 DIV. يتم تقليل الانتشار بعد 4 DIV. بعد 3 DIV ، العديد من الخلايا في الدماغ المتوسط بطني الخضوع نخر (propidium تلطيخ يوديد) وapotosis (immunostaining لكاسباس المشقوق 3). يوضح الشكل 5 مسارات هجرة YFP المسمى رصد الخلايا العصبية في تجربة التصوير في الوقت الفاصل بين شريحة الحاد .
الشكل 1. تخطيطي يوضح طريقة إعداد الثقافات شريحة عضوي النمط. وتعد 300 ميكرون شرائح الدماغ الأفقي sectioning إلى مخ يعمل E12.5 باستخدام vibratome. (أ) عرض تخطيطي السهمي من مخ الفأر E12.5. يشار إلى مستويات من الأبواب. وصفت المنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين في الوردي ، وترد التوقعات في الزرقاء. (ب) من مخططات الشرائح الثلاث التي يمكن الحصول عليها من بطني وظهري إلى ثاتي تحتوي على كل من الدماغ الأمامي (اف ب) و الدماغ المتوسط (MB). نلاحظ أن شريحة واحدة فقط تحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين (ب شريحة). ويمكن تحديد الشريحة المناسبة بناء على موقف البطينين واستمرارية من نسيج المخ الأوسط والدماغ الأمامي (الأسهم ، مقارنة ب المقطع مع مقطع وج). يشار إلى المنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين باللون الوردي ، وصفت المنطقة التي تحتوي على السلائف الدوبامين في السهام ، والأخضر والأزرق تشير التوقعات النامية. (C) هو مثقف وشريحة تحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين على إدراج الغشاء. المختصرات : vMb ، الدماغ المتوسط البطني ؛ DMB ، الدماغ المتوسط الظهرية ؛ القصور ، المهاد ، HB ، الدماغ المؤخر.
الشكل 2. الاسقاطات الدماغ المتوسط الدوبامين من الخلايا العصبية في الثقافات شريحة عضوي النمط تعتمد على سلامة الدماغ المقدم. المناعية لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) لتسمية الخلايا العصبية الدوبامين. (أ) الحاد شريحة (0 DIV)عرض الموقع الطبيعي للخلايا العصبية في الدماغ المتوسط الدوبامين البطني. رأس السهم الأبيض يشير إلى المنطقة التي يتم عرضها في أعلى التكبير في أقحم. لم التوقعات إلى الدماغ المقدم المتقدمة حتى الان. بعد 1 DIV ، والإسقاطات إلى الدماغ المقدم لبدء شكل من الأشكال. توقعات تمتد إلى الدماغ المقدم في DIV 2-3. السهام البيضاء تدل على مكان وجود أجسام الخلايا هو موضح في أعلى التكبير في insets (إطار أبيض). الأسهم الصفراء تسليط الضوء على التوقعات العادية في شرائح سليمة هو موضح في أعلى التكبير في insets (الإطار الأصفر). توقعات الشاذة في تطوير شرائح مع الدماغ المقدم معطوب. السهام الحمراء تشير التوقعات إلى الدماغ المتوسط الشاذة الظهرية هو موضح في أعلى التكبير في insets (أحمر الإطار). يشار الضرر مع النجمة الحمراء. بعد 3 DIV ، فإن معظم شرائح (ن = 5 / 7) وإسقاطات زائغة نحو الدماغ المتوسط الظهرية. (ب) immunostaining TH الأفقية على أجزاء الدماغ المجمدة في مراحل تنموية مختلفة لإظهار التطويرإسقاطات الدوبامين في الجسم الحي. السهام البيضاء تدل على مكان وجود أجسام الخلايا هو موضح في أعلى التكبير في insets (إطار أبيض). الأسهم الصفراء تسليط الضوء على موقف التوقعات المبينة في أعلى التكبير في insets (الإطار الأصفر) ، واختيار مستوى الفروع المجمدة الى المباراة عن كثب على مستوى الثقافات شريحة عضوي النمط. علما بأن الأبواب المجمدة واحد (12 ميكرون) لا تمثل شريحة بأكملها عضوي النمط (300 ميكرون). لذلك ، لوحظت أظهرت التوقعات في E13.5 وE14.5 على أبواب 120 ميكرون أكثر من بطني المقطع الذي يحتوي على أجسام الخلايا (النجمة الصفراء).
الشكل 3. ثقافات الدماغ المتوسط شريحة الاكليلية الملون لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) كعلامة على الخلايا العصبية الدوبامين. (AC) بعد DIV شرائح 1 و 2 أو 3. الخلايا العصبية الدوبامين تطوير التوقعات زائغة نحو الدماغ المتوسط الظهرية (صسهام ED). النصال تظهر في موقع الهيئات الخلية الدوبامين.
الشكل 4. تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء في خلية ثقافات عضوي النمط شريحة الدماغ المتوسط. (أ) وصفت الخلايا المتكاثرة من خلال إضافة BrdU (50 نانوغرام / مل ، سيغما) إلى متوسطة لمدة 18 ساعة الثقافة وبعد ذلك شرائح لimmunostained BrdU. بعد 1 DIV ، توجد خلايا BrdU المسمى في مناطق البطين (السهام الحمراء). بعد 4 DIV ، والخلايا المتكاثرة أكثر مبعثرة ، ولم يعد الحفاظ على منطقة البطين متميزة. (ب) وصفت من قبل خلايا نخرية إضافة يوديد propidium (1μg/μL ، سيغما) إلى وسيلة للثقافة وتصور 2 ساعات بواسطة المجهر مضان. بعد 1 DIV ، والدماغ المتوسط البطني (vMb) ليس نخرية ، ولكن يمكن أن ينظر إلى العديد من الخلايا يوديد propidium المسمى في الدماغ المتوسط والدماغ الأمامي الظهري. بعد 3 DIV بقاء الخلية النقصان في بطني midbraفيها شريط مقياس : 500 ميكرون (C) لImmunostaing كاسباس 3 المشقوق لتصور خلايا أفكارك. في 1 أو 2 DIV ، الخلايا العصبية الدوبامين قليلة فقط (TH) هي أفكارك. بعد 3 DIV ، تبدأ الخلايا العصبية الدوبامين على الخضوع لموت الخلايا المبرمج. لوحات في الوسط وعلى اليمين أعلى تكبير المنطقة محاصر في لوحات اليسار. أعلى تكبير الصور هي التوقعات الكثافة القصوى من z - أكوام من الإطارات 14-16. وقد اتخذت كل الصور 0.5 ميكرون مع Apotome زايس مجموعة المتابعة.
الشكل 5. YFP الطريق المهاجرة التي تحمل علامات الخلايا العصبية في شريحة الحادة. (A) شريحة أفقية تستخدم لمرور وقت التصوير YFP المسمى الخلايا العصبية. وقد حضنت الشريحة لمدة 5 ساعات قبل التصوير. وصفت الخلايا باستخدام محرض لجنة المساواة العرقية / loxP النظام 6. SHH الفئران والجرذان CreER 8 ROSA مراسل loxP للتوقف loxP - 9 نحن EYFPإعادة استخدامها. وبفعل إعادة التركيب من أليل مراسل روزا (والتعبير EYFP) في الخلايا التي تعبر عن CreER (SHH ، معربا عن الخلايا) ، ولكن فقط على إدارة تاموكسيفين (سيغما). في هذا المثال ، كانت تدار تاموكسيفين (3 ز mg/40 الجسم الوزن) على الفئران الحوامل في E8.5. هذا التجريبية انشاء النتائج في المقام الأول في وسم السلائف الدوبامين من الخلايا العصبية وأحفادهم في الدماغ المتوسط 10،11 البطني. شريط الحجم : 500 ميكرون. (ب) تتبع مسار هجرة YFP المسمى الخلايا العصبية في شريحة الحادة. تم الحصول على الوقت الفاصل بين لوحات من الخلايا العصبية التي تحمل علامات YFP مصير تعيين كل 30 دقيقة لمدة 5 ساعات من إجمالي 30 دقيقة على محوري مجهر المراقبين زايس (الهدف EC PlnN 10X / 0.3). وحضنت شرائح في غرفة البيئية (حاضنة XLS1 Pecon) عند 37 درجة مئوية ومزودة CO 2 5 ٪ خلال التصوير. ويتميز الموقف الأولي للخلايا مع السهام الحمراء ؛ تتسم مواقف الهجرة مع النجمة الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ثقافة شريحة عضوي النمط الطريقة المعروضة هنا يوفر النظام على المدى القصير في تحليل المختبر لتطوير الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات هجرتها والإسقاط في الدماغ المتوسط في بطني الجنينية. وجدنا أن هناك عددا من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي ينبغي أن حضر بعناية من أجل الحصول على شرائح التي تسمح للتطور الطبيعي للخلايا العصبية الدماغ المتوسط الدوبامين البطني. الخطوة الأكثر أهمية هو تشريح الدماغ الجنينية ، والذي يجب أن يكون على حد سواء بسرعة ودقة. على النقيض من جيل من شرائح المخ الكبار ، لا بد من قسم العقول على vibratome مجهزة بنظام تبريد واستخدام الترددات المنخفضة مجتمعة مع سرعة عالية في الحصول على شرائح سليمة من E12.5 العقول. أخيرا ، لاحظنا أنه لا بد من شرائح مقطوع في الطائرة الأفقي بحيث بالإضافة إلى الدماغ المتوسط البطني يتم تضمين المناطق المستهدفة الدماغ المقدم من الإسقاطات الدوبامين في شريحة.لاحظنا أيضا أن الدماغ المقدم يجب أن تكون سليمة في هذه الشرائح من أجل الإسقاطات الدوبامين الطبيعي أن تتطور. في شرائح الإكليلية ، والمناطق المستهدفة الدماغ المقدم من الخلايا العصبية الدوبامين غائبة وشكل الخلايا العصبية الشاذة التوقعات إلى الدماغ المتوسط الظهرية.
نظهر يمكن الحفاظ على الشرائح التي تم الحصول عليها بعد بروتوكول لدينا في المختبر لمدة تصل إلى 3 أيام ، وأن الخلايا العصبية الدوبامين الحفاظ على وضعها الطبيعي والإسقاطات الدماغ المقدم. علاوة على ذلك ، هو الحفاظ على القدرة التكاثري السلائف منطقة البطين في جميع أنحاء شريحة. ومع ذلك ، بعد أكثر من 3 أيام في الثقافة ، والجدوى من شرائح يقلل بشكل كبير. وبالتالي ، يمكن استخدام شريحة الثقافات التي تم الحصول عليها من أمخاخ E12.5 لتقييم الخطوات المبكرة في الهجرة العصبية الدوبامين والتمايز ، ولكن لا يمكن استخدامها لتجارب طويلة الأمد. لتقييم مراحل لاحقة من تطور الدماغ المتوسط ، وتوليد شرائح من العجوز قليلايمكن أن تكون الأجنة ص بديل.
نظهر المزيد من التي يمكن استخدامها لعضوي النمط الثقافات شريحة الوقت الفاصل بين التصوير السلائف الدماغ المتوسط بطني وذريتهم ، والتي كانت تسمى في الجسم الحي باستخدام الخرائط الجينية مصير النهج. منذ الأسلوب وسم علامات المقدمة هنا فقط أجسام الخلايا ، وقد استخدمنا شرائح لتتبع هجرة الخلايا العصبية. ومع ذلك ، يمكن للخطوط مراسل المختلفة التي التسمية أيضا إسقاطات محواري تكون مفيدة لمراقبة نمو الخلايا العصبية من المخ الأوسط محواري بطني 12 في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر مارتين Emond Brachmann وإيزابيل لمساعدتهم في تأسيس ثقافة شريحة عضوي النمط النظام وولفغانغ هوبنر ليفيو وغابرييل Bodea لقراءة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر Costantini فرانك لمراسل R26 الفئران وكليف تابين للفئران CreER SHH. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل على جائزة بحوث من وزارة العلوم والبحوث وشمال الراين وستفاليا (البرنامج للزور Förderung دير Rückkehr قصر wissenschaftlichen Spitzennachwuchses أسترالي Ausland ماركا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | EMD Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm | Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 - 30 | |
| Antibodies used for immunostainings: | |||
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Biosciences | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
