Summary
E12.5 murine भ्रूण midbrain से organotypic स्लाइस उत्पन्न विधि वर्णित है. organotypic टुकड़ा संस्कृतियों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स या अन्य वेंट्रल मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स के व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल के पार्ट्स Daza एट अल से संशोधित कर रहे हैं. 7 2007.
1. तैयारी
- एक दिन अग्रिम में तैयार किया जा सकता है
- 1X क्रेब्स बफर (1.5 एल) तैयार: 126 मिमी NaCl, 2.5, 1.2 मिमी मिमी KCl नाह 2 4 पीओ: एच 2 हे, 1.2 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी CaCl 2, 11 मिमी ग्लूकोज, 25 मिमी 3 NaHCO, 7.4 पीएच समायोजित. बाँझ फ़िल्टर (0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार) और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
- 5 एमएल HBSS, 9 एमएल DMEM उच्च ग्लूकोज, 30% ग्लूकोज की 850 μL, 5 एमएल घोड़े सीरम (25%): संस्कृति (20 एमएल) मध्यम तैयार करें. 200 μL 100X Penicllin / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- विच्छेदन शुरू करने से पहले तैयार
- 1X क्रेब्स बफर में 4% कम पिघलने agarose (LMP agarose) के 100 एमएल की तैयारी: माइक्रोवेव समाधान जब तक agarose पूरी तरह भंग कर रहा है और फिर एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में agarose जगह.
- ऊपर Vibra भरेंटोम बफर ट्रे और बहुत ठंडा 1X क्रेब्स बफर के साथ ठंडा तत्व शुरू (4 ° C पर रखने). ब्लेड वाहक और एक स्केलपेल ठीक तूलिका और एक मिनी छिद्रित करने के लिए स्लाइस लेने चम्मच के साथ सेट अप vibratome क्षेत्र में एक धार को ठीक करें. 1x क्रेब्स बफर के साथ स्लाइस इकट्ठा करने के लिए बाँझ पेट्री डिश (35 x 10 मिमी) तैयार करें. बर्फ पर रखें.
- बाँझ पेट्री विच्छेदन के लिए (100 x 15 मिमी) व्यंजन और छोटे बाँझ पेट्री डिश (35 x 10 मिमी) embedding के लिए, छोटे कैंची, दो ठीक संदंश (5 Dumont), एक मिनी छिद्रित चम्मच, एक गिलास के साथ विच्छेदन क्षेत्र सेट अप पाश्चर विंदुक एक दौर के साथ पॉलिश आग और बर्फ पर 1 1X क्रेब्स बफर के एल टिप बंद कर दिया. 70% इथेनॉल के साथ सभी विच्छेदन उपकरण पोछो.
- छह अच्छी तरह से एक थाली (1.5 एमएल अच्छी तरह /) के कुओं के लिए मध्यम संस्कृति जोड़ें और यह एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह.
- 1.5 एमएल / अच्छी तरह से बाँझ 1X क्रेब्स बफर और 15 μL Penicilin / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100X) में अच्छी तरह से / के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली तैयार करो. बाँझ शर्तों के तहत, जगह मिलlicell सेल संस्कृति कुओं में सम्मिलित करता है. प्लेस vibratome के लिए छह अच्छी तरह अगले थाली ताकि मस्तिष्क स्लाइसें सेक्शनिंग के तुरंत बाद फिल्टर झिल्ली पर स्थानांतरित किया जा सकता है है.
2. भ्रूण दिमाग के विच्छेदन और एम्बेडिंग
- एक गर्भवती महिला isoflurane माउस का प्रयोग कर anesthetize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (भ्रूण E12.5 मंच पर होना चाहिए) द्वारा माउस बलिदान. संदंश के साथ गर्भाशय खींच कर बाहर माउस के गर्भाशय को काटना. अन्य संदंश का प्रयोग mesometrium गर्भाशय से दूर अलग है. ठंडा 1X क्रेब्स बफर में गर्भाशय प्लेस. एक ठीक संदंश का प्रयोग भ्रूण से गर्भाशय, रीचर्ट झिल्ली और आंत की जर्दी थैली की मांसपेशियों दीवार अलग. गर्भाशय से भ्रूण निकालें. Dissected भ्रूण बाँझ 1X क्रेब्स बफर के साथ एक अलग पेट्री डिश में रखें.
- Stereomicroscope तहत मस्तिष्क काटना. मस्तिष्क टुकड़े करना करने के लिए, पहले से भ्रूण के सिर में कटौती. सिर फिक्ससिर (आंख स्तर) के माध्यम से ठीक संदंश भेदी द्वारा. ध्यान से त्वचा और खोपड़ी निकाल संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें. संदंश का प्रयोग ध्यान से मस्तिष्क लिफ्ट से बाहर है और यह बाँझ 1X क्रेब्स बफर के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए. यह बहुत महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन के दौरान पूरे मस्तिष्क की अखंडता को बनाए रखा है, के बाद से मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान vibratome पर सेक्शनिंग के दौरान समस्याओं (जैसे ऊतक shredding) पैदा करेगा.
- दिमाग में एक बार 4% कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose धो लें. ताजा 4% एलएमपी agarose में एक समय 2-3 दिमाग एम्बेड. भी रूप में संभव बर्फ पर एम्बेड बर्तन रखें. आग पॉलिश दौर टिप करने के लिए दिमाग लिफ्ट तक agarose के नीचे जम है के साथ एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें. दिमाग agarose ब्लॉक के नीचे करने के लिए एक फ्लैट क्षैतिज स्थिति में समझौता करना चाहिए.
- बाद agarose पूरी तरह जम गया है (लगभग 3 मिनट के बाद), दिमाग आसपास agarose और गोंद नमूना मंच पर agarose ब्लॉक ट्रिमvibratome की. जब gluing ब्लॉक, लगता है कि मस्तिष्क के ventral पक्ष मंच के समानांतर है, क्योंकि दिमाग एक क्षैतिज खंड विमान में कटौती की जानी चाहिए.
3. Vibratome सेक्शनिंग
- सेक्शनिंग के लिए एक धार का प्रयोग करें. बरकरार स्लाइसें प्राप्त करने के लिए यह 4 ° C पर सेक्शनिंग के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
- 50 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर धारा 300 सुक्ष्ममापी मोटी क्षैतिज स्लाइस, ब्लेड आयाम 1.1 मिमी और 25 मिमी / सेकंड के एक गति.
- ठीक तूलिका का प्रयोग करने के लिए एक मिनी छिद्रित चम्मच में टुकड़ा पुश करने के लिए मस्तिष्क स्लाइसें को इकट्ठा करने और एक डिश में उन्हें बाँझ बर्फ ठंड 1X क्रेब्स बफर के साथ स्थानांतरण. चुनें टुकड़ा है कि वेंट्रल मध्यमस्तिष्क ऊतक (चित्रा 1 देखें) . एक E12.5 माउस मस्तिष्क में वहाँ सिर्फ एक 300 सुक्ष्ममापी क्षैतिज टुकड़ा है कि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स सहित वेंट्रल मध्यमस्तिष्क ऊतक होता है.
4. स्लाइस संस्कृति
4.2-4.5 चरण बाँझ शर्तों के तहत बाहर किया जाना चाहिए.
- मस्तिष्क स्लाइसें एक Millicell 1x क्रेब्स बफर (1.2.5 बिंदु देखें) के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली में सेल संस्कृति झिल्ली डालने पर स्थानांतरण. हस्तांतरण के लिए टुकड़ा मिनी छिद्रित चम्मच (ललित विज्ञान उपकरण) और एक ठीक तूलिका का उपयोग करें. 3 स्लाइसें ऊपर एक झिल्ली पर रखा जा सकता है.
- मध्यम संस्कृति के साथ छह अच्छी तरह से थाली टुकड़ा (1.2.5 बिंदु देखें) के साथ झिल्ली स्थानांतरण. झिल्ली के शीर्ष मध्यम द्वारा कवर नहीं किया जा चाहिए. मस्तिष्क टुकड़ा और ऊपर से नीचे हवा से मध्यम प्राप्त.
- छह अच्छी तरह से एक इनक्यूबेटर में थाली प्लेस 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस यह बहुत महत्वपूर्ण है कि स्लाइस विच्छेदन के प्रारंभिक कदम के बाद इनक्यूबेटर में 2 घंटे के भीतर रखा जाता है. एक और अधिक विस्तारित तैयारी के समय स्लाइस की गरीब अस्तित्व में परिणाम कर सकते हैं.
- स्लाइसें 3 दिनों अप करने के लिए इन विट्रो में रखा जा सकता है. 2 एन डी दिन पर संस्कृति के माध्यम के 50% बदलें.
- समय चूक इमेजिंग शुरू करने से पहले 4-5 घंटे के लिए स्लाइस इनक्यूबेटर में पुनर्प्राप्त करते हैं.
- समय चूक इमेजिंग के लिए, झिल्ली डालने पर स्लाइसें रखने और एक 35 मिमी Ibidi μ पकवान (डिश के तल उच्च ऑप्टिकल गुणवत्ता के साथ सामग्री के होते हैं) में डालने के हस्तांतरण.
- पकवान संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल प्लस 1.5 μL ascorbic एसिड (200 मिमी) जोड़ें. Ascorbic एसिड phototoxicity खिलाफ स्लाइस बचाता है.
- 37 में एक पर्यावरण कक्ष में स्लाइस सेते डिग्री सेल्सियस समय चूक इमेजिंग के दौरान 5% सीओ 2 के साथ.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 E12.5 माउस मस्तिष्क से organotypic टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी चित्रा 2 दिखाता है पता चलता है क्षैतिज organotypic स्लाइस (तीव्र और संस्कृति में कई दिनों के बाद) फार्म E12.5 माउस मस्तिष्क प्राप्त है. तुलना बराबर विकास के चरणों में जमे हुए मस्तिष्क वर्गों के लिएदिखाए जाते हैं. Midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase लिए immunohistochemistry (HI) के साथ कल्पना कर रहे हैं. Midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स परियोजना अग्रमस्तिष्क में लक्ष्य. इन अनुमानों E12.5 पर फार्म और बाद के दिनों के दौरान अग्रमस्तिष्क की ओर बढ़ाने के लिए शुरू. हम संस्कृति में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सामान्य विकास के लिए एक अच्छा संकेत के रूप में अग्रमस्तिष्क अनुमानों के विकास पर विचार करें. क्षैतिज स्लाइस मध्यमस्तिष्क में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स उनके उचित अग्रमस्तिष्क लक्षित क्षेत्र की ओर अनुमानों का विस्तार. 3 (इन विट्रो में दिन) DIV या अग्रमस्तिष्क लक्ष्य क्षेत्रों क्षतिग्रस्त कर रहे हैं जब के बाद, न्यायपालिका अनुमानों पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क की ओर का विस्तार. E12.5 midbrain के राज्याभिषेक स्लाइस के उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है . डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स immunostaining के लिए वें पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क न्यायपालिका अनुमानों का विस्तार के साथ कल्पना चित्रा 4 proliferating, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में परिगलित और apoptotic कोशिकाओं के एक विश्लेषण से पता चलता है. BrdU improliferating कोशिकाओं कल्पना munostaining यह दर्शाता है कि कोशिकाओं के बाद एक DIV संस्कृति की शर्तों के तहत पैदा. प्रसार 4 DIV के बाद कम है. 3 DIV के बाद, वेंट्रल midbrain में कई कोशिकाओं (propidium आयोडाइड धुंधला) परिगलन और apotosis (cleaved कस्पासे-3 के लिए immunostaining) चित्रा 5 से गुजरना YFP लेबल एक तीव्र टुकड़ा में एक समय चूक इमेजिंग प्रयोग में निगरानी न्यूरॉन्स के प्रवासी रास्तों से पता चलता है .
चित्रा 1 organotypic टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी illustrating योजनाबद्ध. 300 सुक्ष्ममापी क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइसें एक E12.5 vibratome का उपयोग मस्तिष्क सेक्शनिंग द्वारा तैयार कर रहे हैं. (ए) एक E12.5 माउस मस्तिष्क के योजनाबद्ध बाण के समान दृश्य. वर्गों के स्तर का संकेत कर रहे हैं. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स युक्त क्षेत्र गुलाबी में दिखाया गया है, अनुमानों को नीले रंग में संकेत कर रहे हैं. (बी) के तीन स्लाइसें कि पृष्ठीय से प्राप्त किया जा सकता है Schematics वेंट्रल और थाटी दोनों (Fb) अग्रमस्तिष्क और मध्यमस्तिष्क (एमबी) होते हैं. ध्यान दें कि केवल एक टुकड़ा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (टुकड़ा ख) शामिल हैं. उपयुक्त टुकड़ा निलय और मध्यमस्तिष्क अग्रमस्तिष्क और ऊतक (तीर, खंड खंड एक और ग के साथ ख तुलना) की निरंतरता की स्थिति के आधार पर पहचाना जा सकता है है. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स युक्त क्षेत्र गुलाबी में संकेत दिया है, डोपामिनर्जिक व्यापारियों वाले क्षेत्र हरे, नीले तीर में दर्शाया गया है के विकास के अनुमानों से संकेत मिलता है. (सी) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स युक्त टुकड़ा झिल्ली आवेषण पर सभ्य है. लघुरूप, DMB, पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क; Hyp, hypothalamus, एचबी, hindbrain वीएमबी, वेंट्रल मध्यमस्तिष्क:.
चित्रा 2. Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में midbrain डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अनुमान अग्रमस्तिष्क की अखंडता पर निर्भर हैं. Tyrosine hydroxylase (HI) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स लेबल के लिए immunohistochemistry. (ए) तीव्र टुकड़ा (0 DIV)वेंट्रल midbrain में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सामान्य स्थान दिखा. सफेद arrowhead क्षेत्र है कि इनसेट में उच्च बढ़ाई में दिखाया गया है है इंगित करता है. अग्रमस्तिष्क के लिए अनुमान अभी तक विकसित नहीं है. 1 DIV के बाद, अग्रमस्तिष्क के लिए अनुमानों के लिए फार्म शुरू करते हैं. अनुमान 2-3 DIV पर अग्रमस्तिष्क में विस्तार. व्हाइट arrowheads insets में उच्च आवर्धन (सफेद फ्रेम) में दिखाया गया है सेल शरीर के स्थान का संकेत मिलता है. पीला तीर बरकरार insets में उच्च आवर्धन (पीला फ्रेम) में दिखाया स्लाइस में सामान्य अनुमानों पर प्रकाश डाला. न्यायपालिका अनुमानों क्षतिग्रस्त अग्रमस्तिष्क के साथ स्लाइस में विकसित. लाल तीर पृष्ठीय insets में उच्च आवर्धन (लाल फ्रेम) में दिखाया मध्यमस्तिष्क न्यायपालिका अनुमानों से संकेत मिलता है. नुकसान लाल तारांकनों के साथ संकेत दिया है. 3 DIV के बाद, सबसे स्लाइस (n = 5 / 7) पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क की ओर न्यायपालिका अनुमानों था. (बी) क्षैतिज विभिन्न विकासात्मक चरणों में जमे हुए मस्तिष्क वर्गों पर वें immunostaining विकास को दिखाने के लिएvivo में डोपामिनर्जिक अनुमानों के. व्हाइट arrowheads insets में उच्च आवर्धन (सफेद फ्रेम) में दिखाया गया है सेल शरीर के स्थान का संकेत मिलता है. पीला तीर insets (पीला फ्रेम) में उच्च आवर्धन में दिखाया अनुमानों की स्थिति पर प्रकाश डाला जमे हुए वर्गों के स्तर को बारीकी से organotypic टुकड़ा संस्कृतियों के स्तर मैच चुना गया था. ध्यान दें कि एकल जमी वर्गों (12 सुक्ष्ममापी) पूरे organotypic टुकड़ा (300 सुक्ष्ममापी) का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इसलिए, E13.5 और E14.5 पर दिखाया अनुमानों सेल शरीर (पीले तारांकनों) युक्त खंड से 120 सुक्ष्ममापी अधिक वेंट्रल वर्गों पर मनाया गया.
चित्रा 3 midbrain राज्याभिषेक टुकड़ा संस्कृतियों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर के रूप में tyrosine hydroxylase (HI) के लिए दाग. (एसी) स्लाइस 1, 2 या 3 DIV के बाद. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पृष्ठीय (मध्यमस्तिष्क आर की ओर न्यायपालिका अनुमानों विकसितएड तीर). Arrowheads डोपामिनर्जिक सेल निकायों के स्थान दिखा.
चित्रा 4 सेल और मध्यमस्तिष्क organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में सेल व्यवहार्यता प्रसार. (ए) proliferating कोशिकाओं BrdU (50 एनजी / एमएल, सिग्मा) के अलावा द्वारा 18 एच. के लिए मध्यम संस्कृति लेबल किया गया स्लाइसें बाद BrdU के लिए immunostained थे. 1 DIV के बाद, BrdU लेबल कोशिकाओं निलय क्षेत्रों (लाल तीर) में स्थित हैं. 4 DIV के बाद, proliferating कोशिकाओं को और अधिक बिखरे हुए हैं और एक अलग निलय क्षेत्र नहीं रह बनाए रखा है. (बी) परिगलित कोशिकाओं propidium आयोडाइड के अलावा संस्कृति के माध्यम से 2 बजे के लिए (1μg/μL, सिग्मा) के द्वारा लेबल थे और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized. 1 DIV के बाद, वेंट्रल मध्यमस्तिष्क (वीएमबी) परिगलित नहीं है लेकिन कई propidium आयोडाइड लेबल कोशिकाओं पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क में देखा जा सकता है है. 3 DIV के बाद सेल व्यवहार्यता वेंट्रल midbra में घट जाती हैअंदर स्केल पट्टी: 500 (सी) सुक्ष्ममापी cleaved कस्पासे-3 के लिए Immunostaing apoptotic कोशिकाओं कल्पना. 1 या 2 DIV में, केवल कुछ डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (HI) apoptotic हैं. 3 DIV के बाद, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को apoptosis से गुजरना शुरू करते हैं. बाईं पैनल में बॉक्सिंग क्षेत्र के मध्य में और दाईं तरफ पैनलों उच्च magnifications हैं. उच्च magnifications छवियों 14-16 फ्रेम के z-ढेर अधिकतम तीव्रता के अनुमानों हैं. छवियाँ एक Zeiss Apotome सेट अप के साथ हर 0.5 सुक्ष्ममापी ले जाया गया.
5 चित्रा एक तीव्र टुकड़ा में YFP लेबल न्यूरॉन्स के प्रवासी मार्ग. (ए) क्षैतिज टुकड़ा समय YFP लेबल न्यूरॉन्स की चूक इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. टुकड़ा इमेजिंग के लिए पहले 5 बजे के लिए incubated किया गया था. हम कक्ष / Cre loxP प्रणाली 6 inducible का उपयोग लेबल श्श्श CreER 8 चूहों और रोज़ा loxP बंद करो loxP - EYFP रिपोर्टर 9 चूहों थे .फिर से इस्तेमाल किया. रोज़ा संवाददाता एलील (और EYFP अभिव्यक्ति) के पुनर्संयोजन कोशिकाओं में प्रेरित किया है कि व्यक्त CreER (श्श्श-व्यक्त कोशिकाओं), लेकिन केवल Tamoxifen (सिग्मा) के प्रशासन पर. इस उदाहरण में, Tamoxifen E8.5 (3 mg/40 जी शरीर के वजन) में गर्भवती चूहों को दिलाई. इस प्रयोगात्मक सेट अप और ventral 10,11 midbrain में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स उनके वंश के व्यापारियों की लेबलिंग में मुख्य रूप से परिणाम. स्केल पट्टी: 500 सुक्ष्ममापी. (बी) एक तीव्र टुकड़ा में YFP लेबल न्यूरॉन्स के प्रवासी मार्ग अनुरेखण. YFP - लेबल भाग्य मैप किए गए न्यूरॉन्स के समय चूक छवियों 5 बजे के कुल समय एक Zeiss माइक्रोस्कोप Axio ऑब्जर्वर (उद्देश्य चुनाव आयोग PlnN / 0.3 10x) पर 30 मिनट के लिए हर 30 मिनट हासिल किया गया. स्लाइसें 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पर्यावरण कक्ष (इन्क्यूबेटर XLS1 Pecon) में incubated रहे थे और इमेजिंग के दौरान 5% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की है. कक्षों की प्रारंभिक स्थिति लाल तीर के साथ चिह्नित है, प्रवास पदों लाल एस्टेरिस्क के साथ चिह्नित कर रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
organotypic टुकड़ा संस्कृति विधि यहाँ प्रस्तुत और भ्रूण वेंट्रल midbrain में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स उनके प्रवासी और प्रक्षेपण मार्गों के विकास के इन विट्रो विश्लेषण में अल्पावधि के लिए एक प्रणाली उपलब्ध कराता है. हमने पाया है कि वहाँ है कि ध्यान से भाग होना चाहिए क्रम में स्लाइस कि वेंट्रल मध्यमस्तिष्क डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सामान्य विकास की अनुमति प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं. सबसे महत्वपूर्ण कदम भ्रूण मस्तिष्क, जो दोनों तेजी से और सटीक किया जाना है के विच्छेदन है. वयस्क मस्तिष्क स्लाइसें की पीढ़ी के लिए इसके विपरीत, यह एक शीतलन प्रणाली और एक उच्च गति के साथ संयुक्त E12.5 दिमाग की बरकरार स्लाइसें प्राप्त करने के लिए एक कम आवृत्ति का उपयोग करने के साथ सुसज्जित vibratome पर दिमाग अनुभाग के लिए महत्वपूर्ण है. अंत में, हम ने कहा कि स्लाइस क्षैतिज प्लेन में sectioned तो हो सकता है कि वेंट्रल मध्यमस्तिष्क अलावा डोपामिनर्जिक अनुमानों के अग्रमस्तिष्क लक्ष्य क्षेत्रों टुकड़ा में शामिल हैं.हम यह भी देखा है कि अग्रमस्तिष्क इन स्लाइस में सामान्य डोपामिनर्जिक अनुमानों को विकसित करने के लिए आदेश में बरकरार है. राज्याभिषेक स्लाइस में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की अग्रमस्तिष्क लक्ष्य क्षेत्रों अनुपस्थित रहे हैं और न्यूरॉन्स पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क न्यायपालिका अनुमानों के रूप में.
हमें दिखाना है कि हमारे प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए प्राप्त स्लाइस इन विट्रो में रखा जा सकता है 3 दिनों के लिए और है कि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स अपने सामान्य स्थिति और अग्रमस्तिष्क अनुमानों को बनाए रखने. इसके अलावा, निलय क्षेत्र के व्यापारियों के proliferative क्षमता टुकड़ा भर में बनाए रखा है. हालांकि, संस्कृति में अधिक से अधिक 3 दिनों के बाद, स्लाइस की व्यवहार्यता नाटकीय रूप से कम हो जाती है. नतीजतन, E12.5 दिमाग से प्राप्त टुकड़ा संस्कृतियों डोपामिनर्जिक neuronal प्रवास और भेदभाव में प्रारंभिक कदम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वे लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए नहीं किया जा सकता है. थोड़ा olde से midbrain विकास, स्लाइस की पीढ़ी के बाद के चरणों का आकलन करने के लिएआर भ्रूण एक विकल्प हो सकता है.
हम आगे बताते हैं कि organotypic टुकड़ा संस्कृतियों वेंट्रल मध्यमस्तिष्क व्यापारियों और उनके वंश, जो vivo में लेबल थे एक आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण दृष्टिकोण का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि लेबलिंग विधि यहाँ प्रस्तुत केवल सेल शरीर के निशान, हम स्लाइस का इस्तेमाल किया है neuronal प्रवास ट्रैक. हालांकि, अलग संवाददाता लाइनों है कि axonal अनुमानों लेबल करने के लिए इन विट्रो में 12 वेंट्रल मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स की axonal परिणाम की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम Martine Emond और इसाबेल Brachmann organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रणाली और वोल्फगैंग Hübner और Liviu गेब्रियल Bodea पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्थापित करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद. हम R26 संवाददाता चूहों श्श्श CreER चूहों के लिए और क्लिफ Tabin के लिए फ्रैंक COSTANTINI धन्यवाद देना चाहूंगा. उत्तर राइन वेस्टफेलिया (Programm zur Förderung der Rückkehr डेस wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland) के विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय से इस अध्ययन में एक अनुसंधान पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | EMD Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm | Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 - 30 | |
| Antibodies used for immunostainings: | |||
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Biosciences | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
