배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em
Summary
E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
마우스 분자 및 유전자 데이터의 풍부한으로 인해 포유류의 두뇌 개발을 연구하는 훌륭한 모델 생물이다. 마우스 배아에 액세스할 수 및 불투명이기 때문에 그러나, 개발 마우스 두뇌는 생체내에서 쉽게 조작 및 이미징에 적합하지 않습니다. 배아 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화가 따라서 광범위하게 체외에 murine 두뇌 개발을 연구하는 데 사용됩니다.의 연결이나 glial 세포의 subpopulations이 형광 단백질이 표시 수 있도록 전 생체내 조작 또는 유전자 변형 생쥐의 사용은 유전자 표현의 수정을 허용합니다. 분류 전지의 동작은 다음 시간에 촬영된 영상을 사용하여 볼 수 있습니다. 시간 경과 이미징 늦게 배아 단계 1-2에서 대뇌 피질의 발전을 기초 셀 동작을 공부하고 특히 성공을 거두었습니다. forebrain 외부의 뇌 지역에서 배아 organotypic 슬라이스 문화 시스템은 덜 잘 establis 아르쓰인. 따라서, 세포의 연결을 마이 그 레이션을 설명하는 시간 경과 영상 데이터의 풍부한은 forebrain 3,4으로 제한됩니다. 그것은 아직 지느러미 뇌를 발견 원칙 복부 뇌 영역에 대한 진정한 보유하고 있는지, 알 수 없습니다. 복부 두뇌에서 뉴런의 연결은 클러스터가 아닌 레이어로 구성 그리고 그들은 종종 자신의 최종 위치에 도달하는 복잡한 철새의 탄도를 받아야 할 수 있습니다. 복부 midbrain은 복부 두뇌 개발에 대해서만 좋은 모델 시스템이 아니지만, 또한 질병 과정에 관련된 dopaminergic 신경로의 연결 인구가 포함되어 있습니다. dopaminergic 신경의 기능과 변성은 성인과 노화 두뇌에 좋은 상세히 조사하고있는 동안, 꼬마들은 차별화 및 마이 그 레이션 단계 5 동안 이러한 뉴런의 행동에 대해 알려져 있습니다. 우리는 여기서 배아 일 (E) 12.5 마우스 복부 midbrain에서 슬라이스 문화의 생성을 설명합니다. 이러한 슬라이스 예찬ures는 체외에서 며칠 동안 dopaminergic 신경 세포 개발을 감시하는 잠재적으로 적합합니다. 우리는 배아 개발이 초기 단계에서 뇌 조각을 생성에 중요한 단계를 강조하고 체외에서 dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 유지하기위한 필요 조건을 토론합니다. 시간 저속 이미징 실험에서 우리는 또한 현재의 결과입니다. 이 실험에서, 복부 midbrain의 엽 성의 전구 물질 (dopaminergic 엽 성의 전구 물질 포함) 및 그들의 자손은 Cre / loxP 기반 inducible 운명 매핑 시스템 6을 사용 모자이크 방식으로 표시했다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 organotypic 슬라이스 문화 방법은 배아 복부 midbrain에서 dopaminergic 뉴런과 철새와 프로젝션 노선 개발을 체외 분석에서 단기간에 시스템을 제공합니다. 우리는 신중하게 복부 midbrain dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 허용 조각을 얻기 위해에 참석해야 프로토콜의 중요한 단계 수가있다는 것을 발견했습니다. 가장 중요한 단계는 빠르고 정확한 모두 수있는 배아 두뇌의 해부입니?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 organotypic 슬라이스 문화 시스템 볼프강 Hübner와 원고의 중요한 읽기위한 Liviu 가브리엘 Bodea를 확립 그들의 도움 마틴 Emond와 이사벨 Brachmann 감사드립니다. 우리는 쉬 CreER 마우스에 대한 R26 기자의 마우스와 클리프 Tabin에 대한 프랭크 Costantini 감사하고 싶습니다. 이 연구는 북 – 라인 베스트 팔렌 (Programm zur Förderung 데르 Rückkehr DES wissenschaftlichen Spitzennachwuchses 호주 민주 공화국 Ausland)의 과학 연구의 교육부에서 연구 수상에 의해 투자되었다.
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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