Summary
Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.
Abstract
El campo de la investigación trofoblasto humano ayuda a comprender el complejo entorno establecido durante la placentación. Debido a la naturaleza de estos estudios, humanos en la experimentación in vivo es imposible. Una combinación de cultivos primarios, cultivos de explantes y las líneas de células del trofoblasto 1 para comprender mejor la invasión de la pared uterina 2 y remodelación de las arterias espirales uterinas por las células del trofoblasto 3,4 extravelloso (EVTS), que se requiere para el éxito del embarazo. A pesar de la riqueza de los conocimientos obtenidos de estos modelos, se acepta que en los modelos de cultivo celular in vitro utilizando EVT-como líneas celulares de pantalla alteración de las propiedades celulares en comparación con sus contrapartes en vivo 5,6. Las células cultivadas en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) mostrar las propiedades morfológicas, fenotípicas y funcionales de las líneas celulares EVT-como el que más se asemejan mucho en la diferenciación utero EVTS, con el aumento de expresión de los genes de la mediación invasión (por ejemplo, metaloproteinasas de matriz (MMP)) y la diferenciación del trofoblasto 7,8,9. El Hospital de Saint-Georges-de células placentarias Línea-4 (SGHPL-4) (donado amablemente por el Dr. Guy Whitley y la Dra. Judith Cartwright) es una línea de células EVT-como el que se utilizó para las pruebas de la RCC.
El diseño del recipiente de cultivo RCC se basa en el principio de que los órganos y tejidos en función de tres dimensiones (3-D) el medio ambiente. Debido a las condiciones de cultivo en la dinámica del buque, incluidas las condiciones de corte fisiológicamente relevantes, las células cultivadas en tres dimensiones forman agregados basados en afinidades naturales celular y diferenciarse en tejidos como organotípicos asambleas 10,11,12. El mantenimiento de una órbita fluido proporciona un bajo cizallamiento, baja turbulencia entorno similar a las encontradas en vivo. Sedimentación de las células cultivadas se ve contrarrestada por el ajuste de la rotaciónvelocidad de la RCC para asegurar una constante caída libre de las células. El intercambio gaseoso ocurre a través de una membrana permeable hidrofóbica en la parte posterior del biorreactor. Al igual que sus padres en el tejido vivo, RCC células cultivadas son capaces de responder a los químicos y los gradientes moleculares en tres dimensiones (es decir, en su superficie apical, basal y lateral), ya que se cultivan en la superficie de cuentas microportadores porosa. Cuando se cultiva en dos dimensiones monocapas sobre superficies impermeables como el plástico, las células se ven privadas de esta importante comunicación en su superficie basal. En consecuencia, las limitaciones espaciales impuestas por el medio ambiente afectan profundamente a cómo el sentido y las señales de las células de decodificar el microambiente que rodea, lo que implica un papel importante para el medio en 3-D 13.
Hemos utilizado la RCC para diseñar biológicamente significativos modelos 3-D de diversos tejidos epiteliales humanas 7,14,15,16. De hecho, muchos informes anteriores han demonstrated que las células cultivadas en el RCC puede asumir fenotipos fisiológicamente relevantes que no han sido posible con otros modelos 10,17-21. En resumen, la cultura de la RCC representa una forma fácil, reproducible y de alto rendimiento plataforma que ofrece un gran número de células diferenciadas que son susceptibles a una variedad de manipulaciones experimentales. En el siguiente protocolo, utilizando EVTS como ejemplo, que describa claramente los pasos necesarios para cultivar células en tres dimensiones adherentes en la RCC.
Protocol
1. Preparación de bolas de colágeno
- Antes de EVTS de carga para 3-D de cultivo de células, se necesita para preparar las cuentas microportadores Cytodex-3:
- Pesar la cantidad apropiada de Cytodex-3 cuentas necesarios para el experimento. Este protocolo está adaptado para el vaso de 10 ml RCC, en la que 0,05 g de granos se necesitan. Para que un buque 50ml RCC, la escala correspondiente. En un tubo cónico de 50 ml autoclavable, mezclar 250 mg Cytodex-3 perlas con 12 ml de fosfato tamponado Dulbecco (DPBS). Esta cantidad es suficiente para 5 buques RCC.
- Asegurar un volumen adecuado está presente en el tubo cónico, como el proceso de autoclave dará lugar a la evaporación. Libremente tapar el tubo y autoclave durante 10 minutos a 110 ° C.
- Retire el tubo cónico en la finalización del ciclo de autoclave y dejar que la solución de cuentas Cytodex-3 que se enfríe.
- Después de que el tubo cónico se ha enfriado a temperatura ambiente, una técnica estéril para obtener un volumen total de 12.5ml utilizando 1X DPBS.
- Cap y almacenar el preparado Cytodex-3 cuentas a temperatura ambiente. Permita que los granos se hinchan y preparado para enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. La preparación por encima de Cytodex-3 cuentas se establecen cinco vasos de 10 ml RCC. Hemos observado que el almacenamiento prolongado de Cytodex-3 cuentas a temperatura ambiente se traducirá en una disminución del rendimiento, como el colágeno va a desestabilizar después de aproximadamente un mes. Cytodex-3 cuentas varían en tamaño desde 133 hasta 215 micras.
2. Preparación de medios
Preparar 1 litro de RCC-2 optimizado GTSF los medios de comunicación (adaptado de 22), que consiste en un 40% MEM alfa, además de los suplementos y el 60% L-15 de Leibovitz medios de comunicación (adaptado de 22). En primer lugar, preparar 400 ml en el volumen total del MEM alfa complementado con:
Bicarbonato de sodio 21.2mM
0,06% de peptona
La fructosa 0,7 mm
La galactosa 1.4mm
Glucosa 5,6 mm
HEPES 1%
1% de L-glutamina
0,5% SUS
10% FBS- Para preparar una solución de reserva de los STI, se disuelven en 5 ml estéril acidificada H 2 O preparados por la adición de ácido acético glacial (aproximadamente 0.05 ml). Agitar para disolver, seguir con 45 ml de agua estéril.
- Pesar suficiente L-15 de Leibovitz en polvo de 600 ml de medio de disolución en el grado de cultivo de tejidos H 2 O.
- Obtener un volumen total de medio de cultivo celular de 1 litro con L-15 de Leibovitz medio. Filtro-esterilizar y almacenar a 4 ° C en la oscuridad. Añadir 1% de penicilina-estreptomicina individualmente a cada parte alícuota del medio utilizado.
- Formulaciones de muchos medios que no sean GTSF-2 medios de comunicación han sido probados con éxito en la RCC. Cada laboratorio debe decidir por sí mismos cuál es el medio óptimo para el experimento que se realiza.
3. Las células y la incubación de bolas
- Propagar la EVTS a ~ 80% de confluencia, y contar con trypsinize las prácticas aceptadas de cultivo celular.
- Suspender 1x10 6 EVTS en 4 ml de agua tibiaed los medios de comunicación.
- Mezclar cuidadosamente preparado Cytodex-3 cuentas. El uso de técnicas estériles, quitar 2,5 ml de cuentas preparados con una punta ancha, 10ml serológicas pipeta y transferir a un tubo cónico de 15 ml sin usar. Tenga en cuenta que puede haber una pequeña pérdida de cuentas que al unirse a la pipeta.
- Deje que el Cytodex-3 cuentas a instalarse en la parte inferior del tubo. Después de la sedimentación, uso una pipeta para retirar la capa superior de DPBS sin molestar a las cuentas Cytodex-3.
- Mezclar el 1x10 6 EVTS preparado en los medios de comunicación con el preparado Cytodex-3 cuentas.
- Incubar la mezcla de células de perlas a temperatura ambiente durante 30 min. Periódicamente, mezclar suavemente. Incubar durante 30 min a 37 ° C y 5% CO 2. Periódicamente, mezclar suavemente.
4. Carga de la RWV
- En una cabina de flujo laminar, eliminar un RCC de 10 ml de la caja y colocarlo en una placa estéril, la cultura 6-y para la estabilidad. Consulte la Figura 1 para ver un diagrama etiquetado de la RCCS.
- Retire el tapón grande del puerto.
- Obtener un volumen total de la incubación de células cordón mezcla de 10 ml con medio calentado.
- Cargar el celular / cordón mezcla-en la RCC a través del puerto de gran tamaño. La RCC se debe inclinar a un ángulo de 45 ° (hasta el puerto grande) cuando se carga para facilitar la eliminación de burbujas de aire posible. Evitar la acumulación de la presión positiva al llenar el vaso poco a poco y de manera constante.
- Vuelva a colocar el tapón en el gran puerto.
- Quite los pistones de las jeringas de 3 ml y las jeringas vacías en los pequeños puertos. Añadir 1-3 ml de los medios de comunicación a cada jeringa. Lentamente abra las dos válvulas. Vuelva a colocar los pistones de la jeringa en las jeringas con suavidad. Añadir los medios de comunicación de una jeringa hasta que las burbujas se retiran de la cámara interior.
- Recoger los RCC y golpee suavemente el lado haciéndolo girar en frente de ti para comprobar si hay burbujas. Si hay burbujas, hay que sacarlos de la cámara, como burbujas de aire que interfieren con la formación of agregados de células e introducir las fuerzas de cizallamiento. Eliminar las burbujas haciendo girar el RCC hasta que las burbujas se encuentran bajo el pequeño puerto. A continuación, empuje hacia abajo en la jeringa en el lado opuesto a la fuerza de las burbujas en el puerto y fuera de la cámara.
- Cerca de un puerto lateral. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa otras para introducir una pequeña cantidad de presión positiva en el vaso, lo que impide la formación de burbujas. Cierre la válvula del segundo.
- Cargue el RCC en el rotor. Iniciar la rotación a 19rpm en un 37 ° C incubadora de CO 2.
5. Cambio de los medios de comunicación
- Cambiar los medios de comunicación cada dos días durante los tres primeros días, y luego todos los días a partir de entonces.
- Apague el rotor y quite la RCC. Tire de los pistones para crear algunos de succión, retire las jeringas de cada pequeño puerto y lugar de la RCC en un ángulo para que las cuentas de resolver opuesto del gran puerto.
- Después de las cuentas han resuelto, abra una de las válvulas pequeñas ypermitir que los medios de comunicación a salir de la RCC y en un contenedor de residuos. Quite los 2 / 3 de los medios de comunicación de esta manera. Asegúrese de no molestar a las cuentas y para no descartar cualquier agregado.
- Cierre la válvula de pequeña y abierta, el gran puerto. Añadir los medios de comunicación de nuevo en la RCC a través del puerto de gran tamaño. Vuelva a colocar el tapón en el gran puerto.
- Repita los pasos 4,6 a 4,9.
- A medida que el aumento del tamaño de los agregados, es necesario aumentar la velocidad de rotación para mantener en suspensión en todo momento, a ser posible en un patrón circulatorio pequeños a una velocidad óptima. Por lo general, aumentar la velocidad entre 0,3-0,7 rpm después de cada comida una vez que los agregados comienzan a crecer visiblemente.
6. Recolección de células propagadas
- Retire la RCC del rotor. Eliminar las jeringas de cada pequeño puerto y lugar de la RCC en un ángulo para que las perlas pueden resolver opuesto del gran puerto.
- Después de las cuentas han resuelto, abrir una de las válvulas pequeñas y permitir que los medios de comunicación para que fluyade los RCC y en un contenedor de residuos. Retire 1 / 3 de los medios de comunicación de esta manera.
- Cierre la válvula de pequeña y abierta, el gran puerto. Hacer girar suavemente el recipiente para dispersar a los agregados de nuevo el producto. Mezcla de vacío líquido en un tubo cónico de 50 ml estéril. Permita que los agregados recopilados para instalarse en el tubo cónico, antes de usar el sobrenadante a lavar bien el recipiente de cultivo para maximizar la recuperación de los agregados. Los agregados pueden ser utilizados para los ensayos de aguas abajo de inmediato, como la citometría de flujo, ensayos de invasión, inmunofluorescencia y otros.
7. Resultados representante
Un ejemplo de EVT-como las células (SGHPL-4 la línea celular del trofoblasto) obtenidas en los RCC en Cytodex-3 cuentas se muestra en la Figura 2. La línea celular EVT-como muestra proyecciones que se extienden lejos del grupo principal y vinculados a grupos de vecinos. Muchas de las cuentas están totalmente cubiertas con células de propagación. Una vez retirado de la RCC y la plaTed en una matriz extracelular, el EVT-como el 3-D las células cultivadas agresiva invadir y / o migrar (Figura 3). RT-PCR datos confirman el aumento de la expresión de MMP se ve en 3-D en comparación con los agregados tradicionales monocapas de cultivo celular (Figura 4). Curiosamente, los genes no relacionados con la invasión también aumentada en los RCC (Tabla 1) y puede ayudar a delimitar las zonas, como las interacciones inmune con células invasoras trofoblasto.
Figura 1. Representación de dibujos animados del sistema de cultivo celular rotación (RCC).
Figura 2. Micrografía de contraste de fase de un total de representante después de 5 días de crecimiento en un RCC. Las flechas indican las células invasoras y * indica que las cuentas microportadores Cytodex-3.
Figura 4. Zimograma comparativo de gelatina de monocapa y RCC propagado SGHPL-4 EVT-como las células. Forma pro-activa y de la MMP-2 y MMP-9 secretada por las células del trofoblasto RCC crecido (Adaptado, con permiso, de la referencia. 7).
Tabla 1. Resumen de resultados de microarrays de SGHPL-4 células cultivadas en un RCC (Adaptado, con permiso, de la referencia. 7).
- Indica que los genes que estaban por debajo del límite de detección en monocapas.
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Discussion
La técnica de cultivo que aquí se presenta proporciona a los investigadores altamente invasiva EVT-como las células. Ahora se ha reconocido que la pérdida de la diferenciación se produce en monocapas debido a la inhibición de la respuesta celular a agentes químicos y señales moleculares en tres dimensiones (la superficie celular apical, basal y lateral) 10,13. Esta técnica refleja características señaladas en el útero de invadir las células EVT. Como el procedimiento convencional imita el tejido monocapa cinética de tiempo de cultivo, sino que proporciona las células con expresión diferencial, los ensayos comparativos se pueden emplear. Grupos de células pueden ser cosechados para su uso en experimentos en cualquier momento. Pueden ser utilizados como grupos o la degradación del colágeno pueden ser empleados para aislar las células como la suspensión de células individuales. El Cytodex-3 cuentas microportadores pueden ser sustituidos por andamios o cuentas microportadores recubiertas con otras matrices extracelulares (ECM) que pueden ser más favorables a los intereses de los laboratorios individuales específicas. Alternatsivamente, hay muchas otras plataformas 3-D que la cultura puede ser más adecuado a las condiciones específicas de cultivo de células de tipo, como insertos de cultivo celular y el cono frascos de 10,23. Cabe señalar que la cinética de la cultura puede ser diferente en estas circunstancias y debe establecerse de forma individual. Cinética de la cultura puede ser fácilmente probado por la eliminación de las muestras de la RCC a intervalos regulares y análisis de la expresión de marcadores de diferenciación distintiva, la proliferación y viabilidad 15. Proliferación óptima y la cinética de diferenciación puede ser evaluada mediante la comparación de resultados en el tiempo y en contra de las técnicas convencionales de cultivo de tejidos monocapa. Utilizando el SGHPL-4 células como un ejemplo, los agregados fueron retirados todos los días y se tiñeron con Ki67 (para determinar la proliferación) y la caspasa-3 (para determinar la apoptosis), marcadores específicos para los intereses de los laboratorios individuales pueden ser fácilmente intercambiados. La técnica descrita en este documento se puede aplicar al estudio de las arterias espiralesremodelación, la implantación de poca profundidad, y la madre la respuesta inmune a las células invasoras trofoblasto.
Como ha sido publicado previamente, este modelo de celular en 3-D la cultura también puede ser utilizado para una variedad de líneas celulares de otras 17,14-21. En todos los casos, la utilidad del modelo tiene que ser probado por una variedad de marcadores de diferenciación conocidos. Como cualquier modelo in vitro de cultivos celulares, 3-D de cultivos celulares son intrínsecamente reduccionista. No hay un modelo cultural único proporcionará todos los detalles mecánicos, pero cuando se combina con los resultados publicados de otros modelos en 3-D culturas convertido en un modelo adicional valiosa alternativa para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos relacionados con la enfermedad, que puede tener un enorme potencial para el desarrollo de nuevos productos y procedimientos en el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud de subvención del NIH / NICHD # HD051998 (de CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
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