Summary
Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.
Abstract
Het gebied van human trofoblast onderzoek helpt bij het begrijpen van de complexe omgeving die tijdens placentatie. Vanwege de aard van deze studies, de mens in vivo experimenten is onmogelijk. Een combinatie van primaire culturen, Explantatie culturen en trofoblast cellijnen een ondersteuning van ons begrip van de invasie van de baarmoederwand 2 en vermaken van de baarmoeder spiraalvormige arteriën 3,4 door extravillous trofoblast cellen (EVTS), die nodig is voor een succesvolle invoering van de zwangerschap. Ondanks de rijkdom aan kennis uit dergelijke modellen, wordt aanvaard dat in vitro celcultuur modellen met EVT-achtige cellijnen weer te geven cellulaire eigenschappen veranderd in vergelijking met hun tegenhangers in vivo 5,6. Cellen gekweekt in de roterende celkweek systeem (RCC's) display morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen van de EVT-achtige cellijnen die beter na te bootsen onderscheid in uTero EVTS, met een verhoogde expressie van genen bemiddelen invasie (bijv. matrix (MMP's)) en trophoblast differentiatie 7,8,9. De Saint Georges Hospital placenta cellijn-4 (SGHPL-4) (vriendelijk geschonken door dr. Guy Whitley en Dr Judith Cartwright) is een EVT-achtige cellijn die werd gebruikt voor het testen in het RCC.
Het ontwerp van de RCC's cultuur schip is gebaseerd op het principe dat organen en weefsels functie in een drie-dimensionale (3-D)-omgeving. Door de dynamische cultuur omstandigheden in de tank, met inbegrip van voorwaarden van fysiologisch relevante shear, cellen gekweekt in drie dimensies vorm aggregaten op basis van natuurlijke cellulaire affiniteiten en differentiëren naar organotypische weefsel-achtige samenstellingen 10,11,12. Het onderhoud van een vloeistof baan zorgt voor een low-shear, lage turbulentie omgeving die lijkt op omstandigheden in vivo. Sedimentatie van de gekweekte cellen wordt tegengegaan door het aanpassen van de rotatiesnelheid van de RCC's om een constante vrije val van de cellen te verzekeren. Gasuitwisseling gebeurt door middel van een permeabel membraan hydrofoob zich aan de achterkant van de bioreactor. Net als hun ouders weefsel in vivo, RCC volwassen cellen zijn in staat om chemische en moleculaire gradiënten reageren in drie dimensies (dat wil zeggen op hun apicale, basale en laterale oppervlakken), omdat ze worden gekweekt op het oppervlak van de poreuze microdrager kralen. Wanneer ze groeien als twee-dimensionale monolagen op ondoordringbare oppervlakken, zoals plastic, worden de cellen verstoken van deze belangrijke communicatie op hun basale oppervlak. Derhalve zijn de ruimtelijke beperkingen die worden opgelegd door de omgeving diepgaand invloed hebben op hoe cellen zin en decoderen signalen van de omringende micro-omgeving, dus impliceren een belangrijke rol voor de 3-D milieu 13.
We hebben de RCC's om biologisch zinvolle 3-D modellen van de verschillende menselijke epitheelweefsels 7,14,15,16 ingenieur. Inderdaad, veel eerdere rapporten demook aangetoond dat cellen gekweekt in de RCC kan fysiologisch relevante fenotypen die niet mogelijk was geweest met de andere modellen 10,17-21 nemen. Kortom, cultuur in de RCC is een eenvoudige, reproduceerbare, high-throughput platform dat een groot aantal van gedifferentieerde cellen die vatbaar zijn voor een aantal experimentele manipulaties biedt. In het volgende protocol, met behulp van EVTS als een voorbeeld hebben we een duidelijke beschrijving van de stappen die nodig zijn om driedimensionaal cultuur hechtende cellen in het RCC.
Protocol
1. Collageen Bead Voorbereiding
- Voorafgaand aan het laden van EVTS voor 3-D celkweek, moet men de voorbereiding van de Cytodex-3 microdrager kralen:
- Weeg de juiste hoeveelheid van Cytodex-3 kralen die nodig zijn voor het experiment. Dit protocol is aangepast voor de 10 ml RCC's schip, waarbij 0,05 g van kralen nodig zijn. Voor een 50 ml RCC's schip, overeenkomstig schaal. In een 50ml autoclaveerbaar conische buis, 250 mg Cytodex-3 kralen mengen met 12ml Dulbecco fosfaatgebufferde oplossing (DPBS). Dit bedrag is voldoende voor 5 RCC schepen.
- Zorg voor voldoende volume aanwezig is in de conische buis, zoals de autoclaaf proces zal resulteren in verdamping. Losjes dop van de tube en de autoclaaf gedurende 10 minuten bij 110 ° C.
- Verwijder de conische buis bij de voltooiing van de autoclaaf cyclus en laat de Cytodex-3 bead-oplossing om af te koelen.
- Nadat de conische buis is afgekoeld tot kamertemperatuur, gebruik steriele techniek om het totale volume 12.5mL met 1X DPBS.
- Cap en opslaan van de voorbereide Cytodex-3 kralen bij kamertemperatuur. Laat de kralen bereid te zwellen en voorafgaand afkoelen tot kamertemperatuur te gebruiken. De bovenstaande bereiding van Cytodex-3 kralen zorgt voor vijf 10mL RCC schepen. We hebben waargenomen dat langdurige opslag van Cytodex-3 kralen bij kamertemperatuur zal resulteren in verminderde prestaties, als het collageen zal destabiliseren na ongeveer een maand. Cytodex-3 kralen variëren in grootte 133 tot 215 micrometer.
2. Voorbereiding media
Bereid 1L van de RCC's geoptimaliseerde GTSF-2-media (aangepast van 22), die bestaat uit 40% MEM alpha, plus voedingssupplementen en 60% L-15 Leibovitz's media (aangepast van 22). De eerste, 400ml voor te bereiden in het totale volume van de alfa-MEM aangevuld met:
21.2mM natriumbicarbonaat
0,06% pepton
Fructose 0,7 mm
1,4 mm Galactose
Glucose 5,6 mm
1% HEPES
1% L-glutamine
0,5% ITS
10% FBS- Ter voorbereiding op een voorraad oplossing van ITS en los op in 5 ml steriel aangezuurd H 2 O bereid door toevoeging van azijnzuur (ca. 0.05mL). Swirl te ontbinden, volgen met 45 ml steriel water.
- Weeg genoeg L-15 Leibovitz's poeder voor 600ml medium door oplossing in weefselkweek klasse H 2 O.
- Breng het totale volume van de cel cultuur medium tot 1L met L-15-medium Leibovitz's. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C in het donker. Afzonderlijk toevoegen 1% penicilline-streptomycine aan elk aliquot van medium gebruikt.
- Veel media formuleringen anders dan GTSF-2-media zijn met succes getest in de RCC. Individuele laboratoria moeten zelf bepalen welk medium optimaal is voor het experiment wordt uitgevoerd.
3. Cellen en Bead incubatie
- Propageren van de EVTS tot ~ 80% confluentie, trypsinize en tellen met behulp van celkweek aanvaarde praktijken.
- Te schorten 1x10 6 EVTS in 4 ml warmed media.
- Voorzichtig mengen voorbereid Cytodex-3 kralen. Met behulp van steriele technieken, verwijder 2,5 ml van de bereide kralen met behulp van een brede tip, 10ml serologische pipet en over te dragen aan een ongebruikte 15 ml conische buis. Merk op dat er een klein verlies van kralen zijn als dat zij hechten aan de pipet.
- Laat de Cytodex-3 kralen om zich te vestigen op de bodem van de buis. Na de sedimentatie, gebruik maken van een pipet om de bovenste laag van DPBS te verwijderen zonder het verstoren van de Cytodex-3 kralen.
- Meng de 1x10 6 bereid EVTS in de media met de bereide Cytodex-3 kralen.
- Incubeer de cel-kraal mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Periodiek voorzichtig mengen. Incubeer gedurende nog eens 30 min bij 37 ° C en 5% CO 2. Periodiek voorzichtig mengen.
4. Het laden van de RWV
- In een laminar flow kast, haal een 10 ml RCC's uit de verpakking en plaats het in een steriele, 6-well cultuur plaat voor stabiliteit. Zie Figuur 1 voor een label diagram van de RCCS.
- Haal de grote stop van de haven.
- Breng het totale volume van de incuberen cel-kraal mengsel 10mL met verwarmde media.
- Laad de cel / kraal-mengsel in de RCC's door de grote poort. De RCC moet worden gekanteld in een hoek van 45 ° (grote poort up) tijdens het laden om te helpen bij het verwijderen van mogelijke luchtbellen. Voorkom het opbouwen van positieve druk door het vullen van het schip langzaam en gestaag.
- Vervang de stop in de grote haven.
- Verwijder de zuigers van de 3-mL spuiten en plaats de lege spuiten op de kleine havens. Voeg 1-3 ml van de media om elke spuit. Open langzaam de twee kleppen. Plaats de spuit op de zuigers spuiten zachtjes. Voeg media van een spuit totdat alle luchtbellen worden verwijderd uit het inwendige.
- Pak de RCC's en tik dan zachtjes tijdens het draaien het voor u om te controleren op luchtbellen. Als er luchtbellen, moet je ze uit de kamer, zoals luchtbellen zal interfereren met de vorming of cel aggregaten en de invoering van schuifkrachten. Verwijder de luchtbellen door het draaien van de RCC's totdat de bubbels onder de kleine haven. Vervolgens voorzichtig naar beneden druk op de spuit aan de andere kant van de bubbels kracht in de haven en uit de kamer.
- Sluit een kant-poort. Druk voorzichtig op de andere spuit zuiger om een kleine hoeveelheid van de positieve druk te introduceren in het vat, waardoor luchtbellen voorkomt de vorming. Sluit tweede klep.
- Laad de RCC op de rotor. Start de rotatie bij 19rpm in een 37 ° C CO 2 incubator.
5. Het veranderen van de Media
- Wijzig de media om de andere dag voor de eerste drie dagen, daarna elke dag daarna.
- Zet de rotor en verwijder de RCC. Trek de zuigers tot enkele zuigkracht te creëren, het spuiten te verwijderen uit elke kleine haven en de RCC plaats op een hoek, zodat de kralen tegenovergestelde van de grote haven af te wikkelen.
- Nadat de kralen zijn allemaal gevestigd, opent een van de kleine kleppen enlaat de media uit stroom van de RCC's en in een afvalcontainer. Verwijder de 2 / 3 van de media op deze manier. Zorg ervoor dat u niet verstoren van de kralen en niet weggooien geen aggregaten.
- Sluit de kleine klep en open de grote poort. Voeg media terug in de RCC's door de grote poort. Vervang de stop in de grote haven.
- Herhaal de stappen 4,6 tot 4,9.
- Als de aggregaten in omvang toenemen, moet je de rotatie snelheid te verhogen om ze in suspensie te houden ten alle tijden, bij voorkeur in een kleine bloedsomloop patroon met optimale snelheid. Over het algemeen, verhoging van de snelheid tussen 0.3-0.7 tpm na elke voeding als de aggregaten zichtbaar beginnen te groeien.
6. Verzamelen gepropageerd Cellen
- Verwijder de RCC's uit de rotor. Haal de spuiten uit elke kleine haven en plaats de RCC's op een hoek, zodat de korrels kunnen vestigen tegenovergestelde van de grote haven.
- Nadat de kralen zijn allemaal gevestigd, opent een van de kleine kleppen en laat de media weg te laten stromenvan de RCC's en in een afvalcontainer. Verwijder de 1 / 3 van de media op deze manier.
- Sluit de kleine klep en open de grote poort. Zwenk het schip naar de aggregaten uiteen te drijven weer in de oplossing. Lege vloeibare mengsel in een steriele 50 ml conische buis. Laat de verzamelde aggregaten in de conische buis af te wikkelen voordat u supernatant grondig wassen van de cultuur schip naar herstel van de aggregaten te maximaliseren. De aggregaten kan worden gebruikt voor downstream assays onmiddellijk, zoals flow cytometrie, invasie assays, immunofluorescentie en anderen.
7. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van EVT-achtige cellen (SGHPL-4 trofoblast cellijn) geteeld in de RCC op Cytodex-3 kralen is weergegeven in Figuur 2. De EVT-achtige cellijn toont projecties uitbreiding van uit de buurt van de belangrijkste cluster en verbonden aan de aangrenzende clusters. Veel van de kralen zijn volledig bedekt met propageren van cellen. Eenmaal uit de RCC's en plated op een extracellulaire matrix, de EVT-achtige 3-D volwassen cellen binnen te dringen agressief en / of migreren (Figuur 3). RT-PCR gegevens bevestigen de verhoogde expressie van MMP's te zien in 3-D aggregaten, in tegenstelling tot de traditionele celcultuur monolagen (figuur 4). Interessant is dat genen niet geassocieerd met invasie ook gereguleerd in het RCC (tabel 1) en kan hulp bij het afbakenen van gebieden zoals het immuunsysteem interacties met binnendringende trophoblasts cellen.
Figuur 1. Cartoon voorstelling van de Rotating Cultuur van de Cel System (RCC).
Figuur 2. Phase contrast microfoto van een vertegenwoordiger aggregaat na 5 dagen groei in een RCC. Pijlen geven binnendringende cellen en * de Cytodex-3 microdrager kralen.
Figuur 4. Vergelijkende gelatine zymogram van de monolaag en RCC's gepropageerd SGHPL-4 EVT-achtige cellen. Pro-en actieve vormen van MMP-2 en MMP-9 werden afgescheiden door de RCC uitgegroeid trofoblast cellen (Aangepast, met toestemming, uit Ref. 7).
Tabel 1. Samenvatting van de microarray resultaten uit SGHPL-4 cellen gekweekt in een RCC (Aangepast, met toestemming, uit Ref. 7).
- Geeft aan genen die waren onder de detectiegrens in monolagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cultuur hier gepresenteerde techniek biedt onderzoekers met zeer invasieve EVT-achtige cellen. Het is nu erkend dat een verlies van differentiatie optreedt in monolagen als gevolg van remming van de cellulaire reacties op chemische en moleculaire signalen in drie dimensies (apicale, basale en laterale celoppervlak) 10,13. Deze techniek geeft de kenmerken vermeld in de baarmoeder op de binnenvallende EVT cellen. Aangezien de procedure nabootst conventionele monolaag weefselkweek tijd kinetiek, maar geeft cellen met differentiële expressie, kan vergelijkende tests worden gebruikt. Cel clusters kunnen worden geoogst voor gebruik in proeven op elk moment. Ze kunnen gebruikt worden als clusters of collageenafbraak kunnen worden gebruikt om cellen als enkele celsuspensie te isoleren. De Cytodex-3 microdrager kralen kunnen vervangen worden door steigers of microdrager kralen bekleed met andere extracellulaire matrices (ECM's) die kunnen worden meer bijdragen tot de individuele laboratoria 'specifieke belangen. Alternatively, zijn er vele andere 3-D-cultuur platforms die mogelijk meer bijdragen tot specifieke celtype kweekomstandigheden, zoals celkweek inserts en spinner flessen 10,23. Opgemerkt moet worden dat de cultuur kinetiek anders kan zijn onder deze omstandigheden en moet individueel worden vastgesteld. Cultuur kinetiek kan eenvoudig worden getest door het verwijderen van monsters van de RCC op regelmatige tijdstippen en analyseren voor de expressie van onderscheidende differentiatie markers, proliferatie, en levensvatbaarheid 15. Optimale proliferatie en differentiatie kinetiek kan worden vastgesteld door het vergelijken van resultaten in de tijd en tegen de conventionele monolaag weefselkweek technieken. Met behulp van de SGHPL-4-cellen als een voorbeeld, aggregaten werden dagelijks verwijderd en gekleurd met Ki67 (om de proliferatie te bepalen) en caspase-3 (apoptose te bepalen), Markers die specifiek zijn voor de individuele laboratoria 'belangen kunnen gemakkelijk worden uitgewisseld. De techniek hierin beschreven kan worden toegepast op de studie van de spiraal slagaderremodeling, ondiepe implantatie, en de moeder immuunresponsen op binnendringende trophoblasts cellen.
Zoals reeds eerder gepubliceerd, kan dit 3-D celcultuur model ook worden gebruikt voor een verscheidenheid van andere cellijnen 17,14-21. In elk geval, de bruikbaarheid van het model moet worden getest door een verscheidenheid aan bekende differentiatie markers. Zoals elke in-vitro celkweek model, 3-D celculturen zijn van nature reductionistisch. Geen enkele cultuur model biedt alle van de mechanistische details, maar in combinatie met gepubliceerde resultaten van andere modellen, 3-D culturen wordt een extra waardevol alternatief model voor het verbeteren van ons begrip van de ziekte-gerelateerde mechanismen, die een enorm potentieel voor de ontwikkeling kan houden van nieuwe producten en procedures in de diagnose, preventie en behandeling van infectieziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health NIH subsidie / NICHD # HD051998 (tot CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I.
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).
