Summary
전통적인 2 차원 세포 배양 기술은 종종 차별화 마커, 크린 시토킨 및 성장 요인과 관련하여 변경된 특성의 결과. extravillous trophoblast 세포 라인과 함께 그림과 같이 회전 세포 배양 시스템의 세 가지 차원 세포 배양 (RCCS)는 이러한 요소 중 많은 표현 reestablishes.
Abstract
인간 trophoblast 연구 분야는 placentation 동안 설립 복잡한 환경을 이해 에이즈. 이러한 연구의 성격으로 인해, 생체내 실험에서 인간이 불가능합니다. 차 문화, explant 문화와 trophoblast 세포 라인 1 조합은 질 벽에 2의 침략과 임신의 성공 구축에 필요한 extravillous trophoblast 세포 (EVTs)에 의해 자궁 나선형 동맥 3,4의 리모델링에 대한 우리의 이해를 지원합니다. 이러한 모델에서 gleaned 지식의 풍부한에도 불구하고, 그것은 자신의 생체내의 대응에 5,6에 비해 EVT 같은 세포 라인을 사용하여 시험 관내 세포 배양 모델에서 세포 속성을 변경 표시 허용됩니다. 회전 세포 배양 시스템 (RCCS)에서 교양 세포가보다 밀접하게 U에서 차별 모방되는 EVT 같은 세포 라인의 형태학의 phenotypic 및 기능 속성을 표시침략 (예 : 매트릭스 metalloproteinases (MMPs))와 trophoblast 차별 7, 8, 9을 중재 유전자의 증가 표현과 tero의 EVTs. 셍 조르즈 병원 Placental 세포 라인 4 (SGHPL - 4) (친절하게 박사 가이 휘틀리 박사 주디스 카트 라이트에 의해 기증) RCCS의 테스트에 사용되었다 EVT 같은 세포 라인입니다.
RCCS 문화 선박의 디자인은 장기와 조직은 3 차원 (3 - D) 환경에서 작동하는 원리에 따라 달라집니다. 3 차원에 재배 생리학 관련 전단 조건을 포함한 선박의 동적 문화 조건, 세포에 의한 자연 세포 동질성을 기반으로 집계를 형성하고 organotypic 조직과 같은 어셈블리 10,11,12으로 구분. 유체 궤도의 유지 보수 생체내에서 발견 조건과 비슷한 낮은 전단, 낮은 난기류 환경을 제공합니다. 배양해 세포의 침전이 회전을 조정하여 반박입니다세포의 지속적인 자유 낙하를 보장하기 위해 RCCS 속도. 가스 교환은 생물 반응기의 뒷면에있는 투과 소수성 막을 통해 발생합니다. 생체내 자신의 부모의 조직과 마찬가지로, RCCS - 성장 세포들은 다공성 microcarrier 비즈의 표면에 양식 때문에 삼차원 (그들, 혀끝의 기초, 그리고 측면 표면에서 IE)에서 화학 및 분자 그라디언트에 응답할 수 있습니다. 플라스틱처럼 스며들지 않는 표면에 2 차원 monolayers으로 성장하면 세포들은 기저 표면에서이 중요한 커뮤니케이 션의 박탈됩니다. 따라서, 환경에 의해 부과된 공간적 제약이 심히 따라서 3 차원 환경 13 중요한 역할을 암시, 주변 microenvironment에서 세포의 감각과 디코딩 신호 방법에 영향을 미칩니다.
우리는 다양한 인간의 상피 조직 7,14,15,16의 생물 학적 의미 3 - D 모델을 엔지니어링하는 RCCS를 사용했습니다. 사실, 많은 이전 리포트는 민주 공화국을 가지고RCCS의 교양 세포가 다른 모델 10,17-21 가능하지 않은 생리학 관련 phenotypes을지지 수 onstrated. 요약에서 RCCS의 문화는 실험 조작의 다양한 의무 아르 차별화된 세포의 큰 번호를 제공하는 쉽고 재현성, 높은 처리량 플랫폼을 나타냅니다. 다음과 같은 프로토콜, 예를 들어 EVTs를 사용하여, 우리는 명확하게 RCCS 세 - 치수 문화 자기편 세포에 필요한 단계를 설명합니다.
Protocol
1. 콜라겐 비드 준비
- 이전 3 차원 세포 배양에 대해로드 EVTs에, 하나는 Cytodex - 3 microcarrier 비즈를 준비해야합니다 :
- 실험에 필요한 Cytodex - 3 구슬의 해당 금액을 달다. 이 프로토콜은 구슬 0.05g이 필요하는, 10ml RCCS 선박에 대한 적응이다. 50ml RCCS 선박 들어, 그에 따라 규모. 50mL autoclavable 원뿔 튜브에 12mL Dulbecco 인산 250 MG Cytodex - 3 구슬을 혼합하면 용액 (DPBS)를 버퍼. 이 금액은 5 RCCS 선박에 대한 충분합니다.
- 압력솥 프로세스가 증발하게됩니다대로 적절한 볼륨의 원뿔 튜브에 존재 확인하십시오. 대충 110 10 분 튜브와 압력솥을 캡 ° C.
- 압력솥주기의 완성에있는 원뿔 튜브를 제거하고 Cytodex - 3 비드 솔루션 괜찮아 수 있습니다.
- 원뿔 튜브 룸 온도 냉각 후 1X DP를 사용하여 12.5mL로 전체 볼륨을 가져다 멸균 기술을 사용하여BS.
- 모자와 실온에서 준비 Cytodex - 3 구슬을 저장합니다. 준비 비즈를 사용하기 전에 실내 온도 팽창하고 냉각 허용합니다. Cytodex - 3 구슬 위의 준비 다섯 10mL RCCS 혈관을위한 것입니다. 우리는 콜라겐이 약 한달 후 불안정하므로 상온에서 Cytodex - 3 구슬의 확장 스토리지, 성능 저하가 발생합니다 것이 관찰했습니다. 133-215 μm의 크기에서 Cytodex - 3 구슬이 다양합니다.
2. 미디어 준비
플러스 보조제 및 60% L - 15 Leibovitz의 미디어 (22에서 적응), 40 % 가상 알파 구성되어 GTSF - 2 미디어 (22에서 적응), 최적화된 RCCS의 1L를 준비합니다. 첫째, 함께 보충 가상 알파의 전체 볼륨에서 400mL 준비 :
21.2mM 나트륨 탄산수 소
0.06 %의 펩톤
0.7mM Fructose와
1.4mM 갈락토 오스
5.6mM 포도당
1 % HEPES
1퍼센트 L - 글루타민
0.5 % ITS
10 % FBS- ITS의 재고 솔루션을 준비하려면, 빙초산 (약 0.05mL)를 추가로 준비 5mL 멸균 산성 H 2 O에 용해. 디졸브로 소용돌이, 45mL 멸균 물을 따르십시오.
- 조직 문화 학년 H 2 O.의 용해에 의한 매체의 600ml 정도로 L - 15 Leibovitz의 분말 달아서 나누다
- L - 15 Leibovitz의 매체 1L로 세포 배양 매체의 전체 볼륨을 가져와. 필터 소독과 4 ° C 저장을 어둠 속이라서. 사용하는 매체의 각 나누어지는 개별적으로 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가합니다.
- GTSF - 2 미디어 이외의 대부분의 미디어 공법이 성공적으로 RCCS에서 테스트되었습니다. 개인 실험실 실험이 수행되고 최적의 어떤 매체에 스스로 결정해야합니다.
3. 세포 비드 인큐베이션
- ~ 80 % confluency에 EVTs을 전파, trypsinize 및 접수 세포 배양 방법을 사용하여 계산합니다.
- 따뜻한의 4mL에 1x10 6 EVTs을 중지에드 미디어.
- 부드럽게 준비 Cytodex - 3 구슬을 섞는다. 무균 기술을 사용하여 다양한 팁, 10mL 피펫 serological 및 미사용 15mL 원뿔 튜브로 전송을 사용하여 준비 구슬 2.5mL를 제거합니다. 그들은 피펫에 연결과 같은 구슬의 작은 손실이있을 수 있습니다.
- Cytodex - 3 구슬은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 침전 후 Cytodex - 3 구슬을 방해하지 않고 DPBS의 최상위 층을 제거하는 pipettor을 사용합니다.
- 준비 Cytodex - 3 구슬과 미디어 1x10 6 준비 EVTs를 섞습니다.
- 30 분 상온에서 휴대 비드 혼합를 품어. 주기적으로 부드럽게 섞는다. 37 ° C와 5% CO 2에서 추가로 30 분 알을 품다. 주기적으로 부드럽게 섞는다.
4. RWV를로드
- 층류 흐름 캐비닛에서 포장에서 10mL의 RCCS를 제거하고 안정성을위한 살균, 6 - 물론 문화 판에 넣습니다. RC의 표시 그림 1 그림을 참조하십시오CS.
- 포트에서 큰 마개를 제거합니다.
- 예열 미디어와 10mL에 잠복기 휴대 비드 혼합의 전체 볼륨을 가져와.
- 큰 포트를 통해 RCCS에 셀 / 비드 - 혼합을로드합니다. RCCS가에 기울어져 있어야 45 ° 각도 (대형 포트 이상) 잠재적인 기포의 제거에 도움에 로드할 때. 천천히 그리고 꾸준히 혈관을 작성하여 긍정적인 압력 업 빌드를 방지합니다.
- 큰 포트에 마개를 교체합니다.
- 3 - ML 주사기의 피스톤을 제거하고 작은 포트에 빈 주사기를 놓습니다. 각각의 주사기에 미디어의 1 3mL 추가합니다. 천천히 두 밸브를 엽니다. 부드럽게 주사기에 주사기 피스톤을 교체하십시오. 모든 거품이 내부 챔버에서 제거되기 전까지는 한 주사기에서 미디어를 추가합니다.
- RCCS를 들고 거품 확인하기 위해 앞에서 그것을 회전하면서 부드럽게 측면을 누릅니다. 모든 거품이있다면 공기 방울이 형성 O 방해하므로, 당신은 챔버의 그들을 받아야합니다F 셀 집계가와 전단 세력을 소개합니다. 거품이 작은 포트에 따라 때까지 RCCS를 회전하여 거품을 제거합니다. 그런 다음 부드럽게 챔버의 항구 밖으로 거품을 강제로 반대편에있는 주사기 아래로 밀어.
- 한쪽 포트를 닫습니다. 부드럽게 형성에서 거품을 방지 용기로 긍정적인 압력의 작은 금액을 소개하는 다른 주사기 피스톤을 아래로 밀어. 둘째 밸브를 닫습니다.
- 회전자에 RCCS을로드합니다. 37 ° C CO 2 배양기에서 19rpm에서 회전을 시작합니다.
5. 미디어 변경
- 매일 이후 다음 첫 사흘 동안 매일 미디어를 변경합니다.
- 날개를 끄고 RCCS를 제거합니다. 일부 흡입을 만드는 각각의 작은 항구에서 주사기를 제거하고 구슬이 큰 포트의 반대를 해결 있도록 각도에 RCCS을 배치 피스톤을 당겨.
- 비즈 모두 해결되면 작은 밸브 중 하나를 열고미디어가 RCCS 및 폐기물 용기 밖으로 흘러 수 있습니다. 이러한 방식으로 미디어의 2 / 3를 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록하고 집계를 폐기하지 않는해야합니다.
- 작은 밸브를 닫고 큰 포트를 엽니다. 다시 큰 포트를 통해 RCCS에 미디어를 추가합니다. 큰 포트에 마개를 교체합니다.
- 4.9 - 4.6 단계를 반복합니다.
- 집계 크기가 증가로서 최적의 속도에서 작은 순환 패턴에서 이상적으로, 항상 정지에서 그들을 유지하기 위해 회전 속도를 증가해야합니다. 집계가 가시 성장 시작되면 일반적으로, 각 수유 후 0.3-0.7 RPM 사이의 속도를 향상시킬 수 있습니다.
6. 수집 세포를 전파
- 회전자에서 RCCS를 제거합니다. 각각의 작은 포트에서 주사기를 제거하고 구슬이 큰 포트의 반대를 해결 수 있도록 각도에 RCCS 놓으십시오.
- 비즈 모두 해결되면 작은 밸브 중 하나를 열고 미디어가 흐름 수RCCS 및 폐기물 컨테이너에. 이러한 방식으로 미디어의 1 / 3을 제거합니다.
- 작은 밸브를 닫고 큰 포트를 엽니다. 부드럽게 소용돌이 선박 다시 솔루션에 집계를 해산합니다. 멸균 50ml 원뿔 튜브에 비어있는 액체 혼합물. 수집된 집계 철저하게 집계의 회복을 최대화하기 위해 문화 용기를 씻어 표면에 뜨는 사용하기 전에 원뿔 튜브에 정착하도록 허용합니다. 집계는 같은 유동세포계측법, 침공 assays, immunofluorescence 및 기타로 바로 하류 assays에 사용할 수 있습니다.
7. 대표 결과
Cytodex - 3 구슬에 RCCS 재배 EVT 같은 세포 (SGHPL - 4 trophoblast 세포 라인)의 예제는 그림 2에 표시됩니다. EVT 같은 세포 라인은 떨어져 주요 클러스터에서 확장하고 인접 클러스터에 연결 계획을 표시합니다. 구슬의 대부분이 완전히 전파 세포로 덮여있다. 일단 RCCS 및 괞찮아에서 제거테드는 세포외 기질에 EVT 같은 3 - D 성장 세포가 적극적으로 및 / 또는 마이 그 레이션을 (그림 3) 침공. RT - PCR 데이터는 기존의 세포 배양 monolayers (그림 4) 반대로 3 - D 집계에서 본 MMPs의 증가 표현을 확인합니다. 흥미롭게도, 침략과 연관되지 않은 유전자도 RCCS에 upregulated입니다 (표 1)과 trophoblasts 세포를 침입과 면역 상호 작용 등의 영역을 delineating에 도움이됩니다.
그림 1. 회전 세포 배양 시스템 (RCCS)의 만화 묘사.
그림 2. RCCS 5 일 성장 후 대표 골재의 위상 콘트라스트 현미경. 화살표가 침입 세포를 표시하고 *은 Cytodex - 3 microcarrier 비즈를 나타냅니다.
그림 4. monolayer와 RCCS의 비교 젤라틴 zymogram는 SGHPL - 4 EVT 같은 세포를 증식. MMP - 2와 MMP - 9의 프로 - 적극적인 형태는 RCCS 성장 trophoblast 세포 (참조. 7, 허가, 적응)에 의해 분비되었다.
표 1. RCCS 재배 SGHPL - 4 세포 (참조. 7, 허가, 적응)에서 microarray 결과의 요약.
- monolayers의 감지 한계 이하되었습니다 유전자를 나타냅니다.
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Discussion
여기에 제시 문화 기술은 고도로 침입 EVT 같은 세포와 수사관을 제공합니다. 그것은 지금은 차별화의 손실 세 차원 (꼭대기의, 기저, 그리고 측면 세포 표면) 10,13의 화학 및 분자 단서에 세포 반응의 억제에 의한 monolayers에서 발생되는 인정되었습니다. 이 기술은 EVT 세포를 침해에 대한 utero에 명시된 바와 같이 특징을 반영합니다. 절차는 기존의 monolayer 조직 문화 시간 속도론을 모방한 것이었지만, 차등 표정으로 세포를 제공으로 비교 assays는 고용 수 있습니다. 셀 클러스터는 언제든지 실험에 사용하기 위해 수확 수 있습니다. 클러스터 또는 콜라겐 저하가 단일 세포 현탁액으로 세포를 분리하기 위해 고용 수 있으므로 그들은 사용할 수 있습니다. Cytodex - 3 microcarrier 비즈는 개인 실험실 '특정 이익에 더 도움이되는 수도 있습니다 다른 세포외 매트릭스 (ECMS)로 코팅 공사장 공중 발판을하거나 microcarrier 비즈로 대체 수 있습니다. Alternatively, 세포 배양 삽입 및 회전자 flasks 10,23와 같은 특정 세포 유형 문화 조건에 더 도움이되는 수 많은 다른 3 - D 문화 플랫폼있다. 그것은 문화 속도론 이런 상황에서 다른 수 있으며, 개별적으로 설립되어야한다는 것을인지해야합니다. 문화의 속도론은 쉽게 정기적으로 RCCS에서 샘플을 제거하고 독특한 차별화 마커, 증식 및 생존 15 표현 분석에 의해 테스트 수 있습니다. 최적의 확산과 차별의 속도론은 시간이 지남에 따라 일반 monolayer 조직 문화 기술에 대한 결과를 비교하여 ascertained 수 있습니다. 예를 들어 SGHPL - 4 세포를 사용하여 집계는 매일 제거하고 Ki67 (확산을 결정하기 위해) 및 caspase - 3 (apoptosis를 결정하는)와 스테인드 있었다 개별 실험실의 이익에 맞는가 쉽게 교환할 수 있습니다 마커. 여기에 설명된 기술은 나선형 동맥의 연구에 적용할 수 있습니다리모델링, 얕은 주입 및 침해 trophoblasts 전지에 모성 면역 반응.
이전에 출판되어,이 3 차원 세포 배양 모델은 다른 세포 라인의 다양한 17,14-21 사용할 수 있습니다. 모든 경우, 모델의 유틸리티가 알려진 차별화 마커 다양한으로 테스트되어야한다. 시험 관내 세포 배양 모델에서와 마찬가지로 3 차원 세포 배양 본질적 reductionistic 있습니다. 단일 문화 모델은 기계론의 세부 정보를 모두 제공하지 않지만 3 - D의 문화가 발전을 위해 막대한 잠재력을 보유 수 있습니다 질병 관련 메커니즘에 대한 우리의 이해를 개선하기위한 추가적인 가치 대안 모델이 될 다른 모델에서 출판 결과와 결합하면 진단, 예방 및 전염성 질병 치료에 새로운 제품 및 절차.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 보건 부여 NIH / NICHD # HD051998 (CAM)을 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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