Summary
Традиционный, двумерные методы клеточной культуры часто приводит к изменены характеристики относительно дифференцирования маркеры, цитокинов и факторов роста. Трехмерная культуре клеток во вращающейся системе культуры клеток (РКЦ) восстанавливает выражение многие из этих факторов, как показано здесь с extravillous клеточной линии трофобласта.
Protocol
1. Коллаген из бисера подготовка
- Перед загрузкой EVTs для 3-D клеточных культур, необходимо подготовить Cytodex-3 бусины микроносителей:
- Отвесить соответствующее количество Cytodex-3 бусины, необходимых для эксперимента. Этот протокол адаптирован для судна 10мл РКЦ, в котором 0,05 г из бисера не требуется. Для 50мл судна РКЦ, масштаб соответственно. В 50 мл автоклавируемый коническую трубку, смешайте 250 мг Cytodex-3 бусины с фосфатом 12 мл Дульбекко буферном растворе (DPBS). Эта сумма является достаточной для 5 РКЦ судов.
- Обеспечение адекватного объема присутствует в конической трубе, как автоклав процесс приведет к испарению. Свободно колпачок трубки и автоклаве в течение 10 мин при 110 ° С.
- Удалить конической трубе при завершении цикла автоклава и позволяют Cytodex-3 бусинки решение, чтобы охладиться.
- После конической трубе остынет до комнатной температуры, использование стерильных довести совокупный объем 12.5mL использованием 1X DPBS.
- Кап и хранения подготовленных Cytodex-3 бисером при комнатной температуре. Разрешить подготовлены бисером набухать и охладить до комнатной температуры перед использованием. Над подготовкой Cytodex-3 бусины обеспечит в течение пяти 10 мл судов РКЦ. Мы заметили, что длительного хранения Cytodex-3 бисером при комнатной температуре может привести к снижению производительности, так как коллаген дестабилизирует примерно через месяц. Cytodex-3 бусины в диапазоне размеров от 133-215 мкм.
2. Подготовка медиа
Подготовка 1L РКЦ оптимизированы GTSF-2 средства массовой информации (адаптировано из 22), которая состоит из 40% MEM альфа, плюс добавки и 60% L-15 средств массовой информации в Лейбовиц (адаптировано из 22). Во-первых, подготовить 400 мл в общем объеме MEM альфа дополнен:
21.2mM бикарбоната натрия
0,06% пептон
Фруктоза 0,7 мм
1,4 мм Галактоза
Глюкоза 5.6мм
1% HEPES
1% L-глютамин
0,5% ЕЕ
10% FBS- Для подготовки исходного раствора ИТС, растворить в 5 мл стерильной подкисленных H 2 O подготовленный того ледяной уксусной кислоты (около 0.05mL). Swirl растворяться, следовать с 45 мл стерильной воды.
- Отвешивать достаточно L-15 порошок Лейбовиц для 600 мл среды растворяясь в ткани культуры класса H 2 O.
- Довести общий объем клеточной среде культуры 1L с L-15 средний Лейбовиц в. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° С в темноте. Добавьте 1% пенициллин-стрептомицина индивидуально к каждому аликвоту среда, используемая.
- Многие формулировки средств массовой информации, кроме GTSF-2 СМИ были успешно протестированы в РКЦ. Индивидуальные лаборатории должны решить для себя, какие среды является оптимальным для эксперимента может быть исполнено.
3. Клетки и бисера Инкубационный
- Распространить EVTs до ~ 80% слияния, trypsinize и рассчитывать с использованием принятых практик культуре клеток.
- Приостановить 1x10 6 EVTs в 4 мл теплойред СМИ.
- Аккуратно перемешайте подготовлены Cytodex-3 бусы. Использование стерильных техник, удалите 2,5 мл подготовленных бисером, используя широкий наконечник, 10 мл пипетки серологические и передачи неиспользованных 15 мл коническую трубку. Обратите внимание, что могут быть небольшие потери из бисера, как они придают пипетки.
- Разрешить Cytodex-3 бусины, чтобы осесть на дне пробирки. После осаждения, использование пипетки для удаления верхнего слоя DPBS, не нарушая Cytodex-3 бусы.
- Смешайте подготовленные 1x10 6 EVTs в средах с подготовленной Cytodex-3 бусы.
- Инкубируйте клеточной шарик смеси при комнатной температуре в течение 30 мин. Периодически аккуратно перемешать. Инкубировать еще 30 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Периодически аккуратно перемешать.
4. Загрузка RWV
- В кабинете ламинарного потока, удалить 10 мл РКЦ из упаковки и поместить его в стерильную, 6-а культура пластина для стабильности. См. на рисунке 1 представлена диаграмма помечены RCCS.
- Удалите большие пробки от порта.
- Довести общий объем инкубации клеточной шарик смеси 10 мл подогретой СМИ.
- Нагрузка клетки / гранулы-смесь в РКЦ через большой порт. РКЦ должна быть наклонена под углом 45 ° (крупные до порта) при загрузке, чтобы помочь в устранении потенциальных пузырьки воздуха. Не допускать накопление положительного давления, заполнив судно медленно и неуклонно.
- Замените пробку в крупный порт.
- Удалите поршни от 3-мл шприцы и пустые места шприцы на малых портов. Добавить 1-3 мл средств массовой информации для каждого шприца. Медленно откройте два клапана. Замените поршни шприцев на шприцы мягко. Добавить файлы из одного шприца, пока все пузырьки удаляются из внутренней камеры.
- Возьмите РКЦ и мягко нажмите на стороне, а вращая ее перед вами, чтобы проверить пузыри. Если Есть любые пузыри, вы должны получить их из камеры, как пузырьки воздуха будут мешать образованию ое агрегаты клеток и ввести поперечных сил. Удалить пузырьки поворотом РКЦ, пока пузырьки в небольшой порт. Затем осторожно надавите на шприц на противоположной стороне, чтобы заставить пузырьков в порт и из камеры.
- Закройте одну сторону порта. Аккуратно надавите на поршень шприца другими ввести небольшое количество положительным давлением в сосуд, который предотвращает пузырей. Закрыть второй клапан.
- Нагрузка РКЦ на роторе. Начало ротации на 19rpm в 37 ° C CO 2 инкубатора.
5. Изменение СМИ
- Изменение СМИ через день в течение первых трех дней, то каждый день после этого.
- Выключите ротор и удалить РКЦ. Потяните поршни, чтобы создать некоторые всасывания, удалите шприцы друг от небольшой порт и место РКЦ на угол так, чтобы урегулировать бисером противоположность большим портом.
- После бусины имеют все решено, открыть один из небольших клапанов ипозволяют средства массовой информации вытекать из РКЦ и в контейнер для отходов. Удалите 2 / 3 от средств массовой информации в этой манере. Будьте уверены, чтобы не беспокоить бисера и не отказаться от любых агрегатов.
- Закрыть небольшой клапан и откройте большой порт. Добавить файлы обратно в РКЦ через большой порт. Замените пробку в крупный порт.
- Повторите шаги 4.6 - 4.9.
- Как агрегатов увеличиваются в размерах, вам необходимо увеличить скорость вращения, чтобы держать их во взвешенном состоянии в любое время, желательно в небольшой образец кровообращения на оптимальной скорости. Как правило, увеличение скорости между 0,3-0,7 мин после каждого кормления один раз агрегаты начинают расти заметно.
6. Сбор Размножается Клетки
- Удалить из РКЦ ротора. Удалить шприцы друг от небольшой порт и место РКЦ на угол так, чтобы гранулы могут поселиться противоположность большим портом.
- После бусины имеют все решено, открыть один из малых клапанов и позволяют СМИ вытекать изиз РКЦ и в контейнер для отходов. Удалить 1 / 3 от средств массовой информации в этой манере.
- Закрыть небольшой клапан и откройте большой порт. Аккуратно водоворот судна для разгона агрегатов обратно в раствор. Пустые жидкую смесь в стерильный 50 мл коническую трубку. Разрешить собранных агрегатов, чтобы обосноваться в конической трубе, прежде чем использовать супернатант тщательно мыть культуры судно максимального восстановления агрегатов. Агрегаты могут быть использованы для последующих анализов сразу же, как проточная цитометрия, вторжение анализы, иммунофлюоресценции и другие.
7. Представитель Результаты
Примером ЭВТ-подобных клеток (SGHPL-4 трофобласта клеточной линии), выращенных в РКЦ на Cytodex-3 бусины показано на рисунке 2. ЭВТ-как клеточная линия отображает прогнозы расширения от основного кластера и присоединения к соседней кластеров. Многие из бисера полностью покрыты распространяющихся клеток. После извлечения из РКЦ и плаТед на внеклеточного матрикса, ЭВТ-как 3-D выросла клетки агрессивно вторгаются и / или миграции (рис. 3). RT-PCR данные подтверждают повышенную экспрессию ММП увидеть в 3-D агрегатов, в отличие от традиционной культуре клеток монослоя (рис. 4). Интересно, что гены не связаны с вторжением также upregulated в РКЦ (табл. 1) и может помочь в разграничении таких областях, как иммунные взаимодействия с вторжением трофобласта клеток.
Рисунок 1. Мультфильм изображение вращающейся системе культуры клеток (РКЦ).
Рисунок 2. Фазового контраста микрофотография представитель совокупности через 5 дней роста в РКЦ. Стрелки указывают вторжения клетки и * означает Cytodex-3 бусины микроносителей.
Рисунок 4. Сравнительный желатин zymogram монослоя и РКЦ распространяется SGHPL-4 ЭВТ-подобных клеток. Про-и активные формы MMP-2 и ММП-9 выделяется РКЦ выросли клетки трофобласта (адаптировано с разрешения из работы. 7).
Таблица 1. Резюме микрочипов результаты SGHPL-4 клеток, выращенных в РКЦ (адаптировано с разрешения из работы. 7).
- Показывает, гены, которые были ниже предела обнаружения в монослоев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Культура техника, представленные здесь дает следователям с высоко инвазивный ЭВТ-подобных клеток. В настоящее время признано, что потеря дифференциация происходит в монослоя за счет ингибирования клеточных реакций на химические и молекулярные сигналы в трех измерениях (верхушечные, базальные и боковые поверхности клетки) 10,13. Этот метод отражает характеристики отметил внутриутробно от вторжения EVT клеток. Так как процедура имитирует обычные монослоя ткани кинетики культуры времени, но обеспечивает клетки с дифференциального выражения, сравнительные анализы могут быть использованы. Сотовые кластеры могут быть собраны для использования в экспериментах в любое время. Они могут быть использованы в качестве кластеров или деградации коллагена могут быть использованы для изоляции клеток суспензии отдельных клеток. Cytodex-3 бусины микроносителей может быть замещен леса или микроносителей бусины покрыты других внеклеточных матриц (ECMS), которые могут быть в большей степени способствуют специфические интересы отдельных лабораторий. Чередующихсяively, Есть много других 3-D культуре платформ, которые могут быть более благоприятными для конкретного типа клеток условия культивирования, как культура клеток вставками и кок колбы 10,23. Следует отметить, что культура кинетики может быть различным в этих условиях и должны быть установлены индивидуально. Культура кинетики могут быть легко проверены на удалив образцы из РКЦ через регулярные промежутки времени и анализа для выражения отличительные маркеры дифференцировки, пролиферации и жизнеспособности 15. Оптимальное пролиферацию и дифференцировку кинетики может быть установлено путем сравнения результатов с течением времени и с обычными методами ткани монослоя культуры. Использование SGHPL-4 клетки, как, например, агрегаты были удалены ежедневно и окрашивали Ki67 (для определения распространения) и каспазы-3 (для определения апоптоза), маркеры, характерные для интересов отдельных лабораторий "могут быть легко обмениваются. Техника, описанная здесь, могут быть применены к изучению спиральных артерийремонт, мелкий имплантации, и материнской иммунной реакции на вторжение трофобласта клеток.
Как было опубликовано ранее, это 3-D модель клеточной культуре также может быть использована для целого ряда других клеточных линий 17,14-21. В любом случае, полезность модель должна быть проверена с помощью различных известных маркеров дифференциации. Как и любой в пробирке модель культуры клеток, 3-D клеточных культур по своей сути редукционизма. Ни одна модель культуры будет предоставлять все механистические детали, но в сочетании с опубликованными результатами других моделей, 3-D культур стать дополнительной полезной моделью альтернативой для улучшения нашего понимания связанных с болезнью механизмов, которые могут вместить огромный потенциал для развития новых продуктов и процедур в области диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке американского Национального института здоровья грант NIH / NICHD # HD051998 (для CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I.
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).
