Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Summary

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Abstract

O campo de pesquisa trofoblasto humano ajuda na compreensão do ambiente complexo estabelecido durante placentação. Devido à natureza destes estudos, humanos em experimentação in vivo é impossível. A combinação de culturas primárias, as culturas de explante e linhas de células do trofoblasto ^um auxiliar para a compreensão de invasão da parede uterina ² e remodelação das artérias uterinas espiral ^3,4 por células do trofoblasto extravilosas (TEVs), que é necessário para o estabelecimento de sucesso da gravidez. Apesar da riqueza de conhecimentos provenientes de tais modelos, aceita-se que em modelos de células in vitro utilizando linhas cultura EVT-como célula de exibição alterado propriedades celular quando comparados com os seus homólogos em ^5,6 vivo. Células cultivadas em sistema de rodízio de cultura de células (CCRs) exibir as propriedades morfológicas, fenotípicas e funcionais de linhas de EVT-como célula que mais perto imitar diferenciar em uTEVs Tero, com aumento da expressão de genes de mediação invasão (por exemplo metaloproteinases de matriz (MMPs)) e diferenciação do trofoblasto ^7,8,9. O Hospital Saint Georges de células placentária Linha-4 (SGHPL-4) (gentilmente doado pelo Dr. Guy Whitley e Judith Dr. Cartwright) é uma linha de células EVT-like que foi usado para testes no CCRs.

O design do navio cultura RCCs é baseado no princípio de que órgãos e tecidos em função de uma imagem tridimensional do ambiente (3-D). Devido às condições de cultura dinâmica no reservatório, incluindo as condições de cisalhamento fisiologicamente relevantes, as células cultivadas em três dimensões formam agregados com base em afinidades naturais celular e se diferenciar em tecido organotípicas-like assembléias ^10,11,12. A manutenção de uma órbita de fluido proporciona um baixo cisalhamento, o ambiente de turbulência de baixa semelhante às condições encontradas in vivo. Sedimentação das células cultivadas for anulada, ajustando a rotaçãovelocidade do CCRs para assegurar uma constante queda livre de células. Troca de gases ocorre através de uma membrana permeável hidrofóbica localizado na parte traseira do biorreator. Como seus pais tecido in vivo, CCRs de produção de células são capazes de responder a química molecular e gradientes em três dimensões (ou seja, suas superfícies apical, basal e lateral), porque eles são cultivadas na superfície dos grânulos microcarregador poroso. Quando cultivada como bidimensional monocamadas em superfícies impermeáveis, como o plástico, as células são privados dessa comunicação importante em sua superfície basal. Conseqüentemente, as restrições espaciais impostas pelo ambiente afetam profundamente sentido como células e decodificar sinais do microambiente em torno, o que implica um papel importante para o meio 3-D ^13.

Temos usado a CCRs para engenheiro biologicamente significativas modelos 3-D de vários tecidos epiteliais humanas ^7,14,15,16. De fato, muitos relatórios anteriores demtrada que as células cultivadas em CCRs pode assumir fenótipos fisiologicamente relevantes que não foram possíveis com outros modelos ^10,17-21. Em resumo, a cultura na RCCs representa uma tarefa fácil, reprodutível, plataforma de alto rendimento que proporciona um grande número de células diferenciadas que são passíveis de uma variedade de manipulações experimentais. No protocolo a seguir, usando TEVs como exemplo, que descrevem claramente os passos necessários para as células de forma tridimensional de cultura aderente na CCRs.

Protocol

1. Preparação de colágeno Bead

1. Antes de TEVs carregamento para 3-D de cultura de células, é preciso preparar as contas Cytodex-3 microcarregador:
   1. Pesar a quantidade adequada de Cytodex-3 contas necessárias para o experimento. Este protocolo é adaptado para o navio RCCs 10ml, em que 0,05 g de contas são necessários. Para que um navio RCCs 50ml, escala em conformidade. Em um tubo de 50 ml autoclavável cônica, misturar 250 mg Cytodex-3 contas com 12 ml de fosfato tamponada Dulbecco (DPBS). Este montante é suficiente para 5 navios CCRs.
2. Assegurar um volume adequado está presente no tubo cônico, como o processo de autoclave irá resultar em evaporação. Vagamente tampa do tubo e autoclave por 10 minutos a 110 ° C.
3. Remover o tubo cônico na conclusão do ciclo de autoclave e deixar a solução Cytodex-3 talão para esfriar.
4. Após o tubo cônico esfriou a temperatura ambiente, use uma técnica estéril para trazer o volume total de 12.5mL usando 1X DPBS.
5. Tampa e guarde o preparado Cytodex-3 contas à temperatura ambiente. Permitir que as contas preparados para inchar e esfriar a temperatura ambiente antes do uso. A preparação acima de Cytodex-3 contas irá fornecer para cinco navios 10ml CCRs. Temos observado que o armazenamento prolongado de Cytodex-3 contas à temperatura ambiente irá resultar em desempenho reduzido, como o colágeno vai desestabilizar após aproximadamente um mês. Cytodex-3 contas variam em tamanho 133-215 mM.

2. Preparação da mídia

1. Prepare 1L de CCRs otimizado GTSF media-2 (adaptado de ^22), que consiste em 40% MEM alfa, além de suplementos e 60% ​​L-15 Leibovitz de mídia (adaptado de ^22). Primeiro, prepare 400mL no volume total de alfa MEM suplementado com:
   Bicarbonato de sódio 21.2mm
   Peptona 0,06%
   Frutose 0,7 mm
   Galactose 1,4 mm
   Glucose 5.6mm
   HEPES 1%
   1% L-glutamina
   0,5% ITS
   F 10%BS

2. Para preparar uma solução estoque de ITS, dissolver em 5 mL estéreis acidificados H ₂ O preparado por adição de ácido acético glacial (cerca de 0,05 ml). Agite para dissolver, siga com água estéril 45ml.
3. Pesar o suficiente L-15 em pó Leibovitz para 600ml de meio de dissolvendo em cultura de tecidos de grau H ₂ O.
4. Trazer o volume total de meio de cultura celular para 1L com L-15 de médio Leibovitz. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C no escuro. Adicione 1% Penicilina-estreptomicina individualmente para cada alíquota de meio utilizado.
5. Muitas formulações de outros meios de mídia GTSF-2 ter sido testado com sucesso nos CCRs. Laboratórios indivíduo deve decidir por si quais médio é o ideal para o experimento que está sendo executada.

3. Células e Incubação Bead

1. Propagar a TEVs para ~ 80% confluência, trypsinize e contar com práticas aceitas cultura de células.
2. Suspender 1x10 ⁶ TEVs em 4mL de mornoed mídia.
3. Misture delicadamente preparado Cytodex-3 esferas. Usando técnicas estéreis, retire 2,5 ml de contas preparada com a ponta de largura, 10 ml sorológicos pipeta e transferir para um tubo cônico 15mL não utilizados. Note-se que pode haver uma pequena perda de contas que atribuem à pipeta.
4. Permitir que o Cytodex-3 contas para resolver sobre o fundo do tubo. Após a sedimentação, use uma pipeta para remover a camada superior da DPBS sem perturbar as contas Cytodex-3.
5. Misture a 1x10 ⁶ TEVs preparadas em media com o preparado Cytodex-3 esferas.
6. Incubar a mistura de células-grânulo em temperatura ambiente por 30 min. Periodicamente, misture delicadamente. Incubar durante 30 min ainda a 37 ° C e 5% CO _2. Periodicamente, misture delicadamente.

4. Carregando o RWV

1. Em uma câmara de fluxo laminar, remover um RCCs 10 ml da embalagem e colocá-lo em uma placa de cultura estéril, 6-bem para a estabilidade. Consulte a Figura 1 para ver um diagrama do rótulo do RCCS.
2. Remova a tampa do porta grande.
3. Trazer o volume total da mistura de incubação de células-talão até 10 ml com a mídia aquecido.
4. Carregar o celular / mistura-grânulo no RCCs através da porta grande. Os CCRs deve ser inclinado em um ângulo de 45 ° (até grande porto) ao carregar para ajudar na remoção de bolhas de ar em potencial. Evitar acúmulo de pressão positiva através do preenchimento da embarcação lenta e progressivamente.
5. Substituir a tampa do porta grande.
6. Remover os pistões do seringas de 3 ml e coloque as seringas vazias para os portos de pequeno porte. Adicionar 1-3 mL de mídia para cada seringa. Abrir lentamente as duas válvulas. Substitua os pistões seringa na seringas suavemente. Adicionar mídia a partir de uma seringa até todas as bolhas são removidos do interior da câmara.
7. Pegue o CCRs e bata suavemente de lado enquanto gira-lo na frente de você para verificar se há bolhas. Se houver bolhas, você deve levá-los para fora da câmara, como bolhas de ar irá interferir com a formação of agregados celulares e introduzir forças de cisalhamento. Remova as bolhas girando o RCCs até que as bolhas estão sob o pequeno porto. Depois, empurre para baixo sobre a seringa no lado oposto à força as bolhas na porta e fora da câmara.
8. Fechar uma porta lateral. Gentilmente empurre para baixo o pistão outra seringa para introduzir uma pequena quantidade de pressão positiva dentro do vaso, o que impede a formação de bolhas. Feche a válvula segundo.
9. Carregar os CCRs para o rotor. Iniciar a rotação em 19rpm a 37 ° C incubadora de CO _2.

5. Alterando a mídia

1. Troque a mídia todos os dias durante os primeiros três dias, então todos os dias depois.
2. Desligue o rotor e remova o CCRs. Puxe os pistões para criar alguma sucção, retire as seringas de cada pequeno porto e coloque o CCRs em um ângulo de modo que as contas resolver oposto do grande porto.
3. Após as contas têm tudo acertado, abra uma das válvulas pequenas epermitir que os meios de comunicação a fluir para fora do CCRs e em um recipiente de resíduos. Retire 2 / 3 dos meios de comunicação desta forma. Certifique-se de não perturbar as contas e para não descartar qualquer agregados.
4. Feche a válvula de pequenas e abrir a porta grande. Adicionar mídia de volta para o RCCs através da porta grande. Substituir a tampa do porta grande.
5. Repita os passos de 4,6-4,9.
6. Como os agregados aumentam de tamanho, você precisa aumentar a velocidade de rotação para mantê-los em suspensão em todos os momentos, de preferência em um padrão circulatório pequeno na velocidade ideal. Geral, aumentar a velocidade entre 0,3-0,7 rpm após cada mamada, uma vez agregados começar a crescer visivelmente.

6. Coleta de células propagadas

1. Remover o CCRs do rotor. Remove as seringas de cada pequeno porto e coloque o CCRs em um ângulo de modo que as contas poderá resolver oposto do grande porto.
2. Após as contas têm tudo acertado, abra uma das válvulas de pequenos e permitir que os meios de comunicação a fluir para forados CCRs e em um recipiente de resíduos. Retire 1 / 3 dos meios de comunicação desta forma.
3. Feche a válvula de pequenas e abrir a porta grande. Agite suavemente o navio para dispersar os agregados na solução. Mistura líquida vazia em um tubo cônico estéril 50ml. Permitir que os agregados coletados para se estabelecer no tubo cônico antes de usar o sobrenadante para lavar o vaso cultura para maximizar a recuperação de agregados. Os agregados podem ser usados ​​para ensaios de downstream imediatamente, como a citometria de fluxo, ensaios de invasão, imunofluorescência e outros.

7. Resultados representante

Um exemplo de como as células-EVT (SGHPL-4 linha de células do trofoblasto) cultivadas no CCRs em Cytodex-3 contas é mostrado na Figura 2. A linhagem celular EVT-like exibe projeções estende para longe do principal grupo e anexando a clusters vizinhos. Muitas das contas são completamente cobertas com células propagação. Uma vez retirado do CCRs e plated em uma matriz extracelular, a EVT-3-D como células cultivadas de forma agressiva invadir e / ou migrar (Figura 3). RT-PCR dados confirmam o aumento da expressão de MMPs visto em 3-D agregados ao contrário de monocamadas de células tradicionais de cultura (Figura 4). Curiosamente, os genes não associados com a invasão também são upregulated na CCRs (Tabela 1) e pode ajudar no delineamento de áreas tais como interações imune com células invadindo trofoblasto.

Figura 1. Representação dos desenhos animados do Sistema de Rotação de Cultura Celular (CCRs).

Figura 2. Micrografia de contraste de fase de um agregado representante após 5 dias de crescimento em um CCRs. Setas indicam células invasoras e * denota as contas Cytodex-3 microcarregador.

Agregados figura 3. RCCs Grown foram incorporados em géis de fibrina. Invasão através do gel de fibrina foi observada já em (A) 24 horas após a incorporação de fibrina e (B) continuou até 48 horas. Setas indicam células invasoras e * denota as contas Cytodex-3 microcarregador (Adaptado, com permissão, de Ref. 7).

Figura 4. Zymogram gelatina comparativo de monocamada e CCRs propagada SGHPL-4 EVT células semelhantes. Formas pró-ativa e de MMP-2 e MMP-9 foram secretado pelas células trofoblásticas cultivadas CCRs (Adaptado, com permissão, de Ref. 7).

Tabela 1. Resumo dos resultados de microarray SGHPL-4 células cultivadas em CCRs (Adaptado, com permissão, de Ref. 7).

1. Indica genes que estavam abaixo do limite de detecção em monocamadas.

Discussion

A técnica de cultura aqui apresentada fornece aos investigadores altamente invasivo EVT células semelhantes. Ele já foi reconhecido que a perda de diferenciação ocorre em monocamadas devido à inibição da resposta celular a agentes químicos e sinais moleculares em três dimensões (superfícies celulares apical, basal e lateral) ^10,13. Esta técnica reflete características observou in utero invadir células EVT. Como o procedimento imita convencionais monocamada tecido cinética de tempo da cultura, mas fornece as células com expressão diferencial, ensaios comparativos podem ser empregadas. Grupos de células podem ser colhidas para uso em experimentos a qualquer momento. Eles podem ser usados ​​como clusters ou degradação do colágeno pode ser empregada para isolar células como a suspensão única célula. O Cytodex-3 contas microcarregador pode ser substituído por andaimes ou contas microcarregador revestido com outras matrizes extracelulares (ECMs) que pode ser mais favorável aos interesses dos laboratórios individuais específicos. Alternandovamente, existem muitas outras plataformas 3-D cultura que pode ser mais propício para as condições específicas de células do tipo de cultura, como inserções de cultura celular e frascos giratório ^10,23. Note-se que a cinética da cultura poderia ser diferente nestas circunstâncias e deve ser estabelecida individualmente. Cinética de cultura pode ser facilmente testado por remover amostras do CCRs em intervalos regulares e análise de expressão de marcadores de diferenciação distinto, proliferação e viabilidade ^15. Proliferação ideal e cinética de diferenciação pode ser verificada, comparando os resultados ao longo do tempo e contra convencionais monocamada técnicas de cultura de tecidos. Usando o SGHPL-4 células, como exemplo, os agregados foram removidos diariamente e corados com Ki67 (para determinar a proliferação) e caspase-3 (para determinar a apoptose), marcadores específicos para os interesses dos laboratórios individuais podem ser facilmente trocados. A técnica descrita a seguir pode ser aplicada ao estudo da artéria espiralremodelação, implantação rasa, e materna respostas imunes às células invasoras trofoblasto.

Como foi publicado anteriormente, este 3-D modelo de cultura de células também pode ser usado para uma variedade de outras linhagens de células ^17,14-21. Em todos os casos, a utilidade do modelo tem que ser testado por uma variedade de marcadores de diferenciação conhecidos. Como qualquer modelo in vitro de cultura de células, 3-D culturas de células são inerentemente reducionista. Não existe um modelo único de cultura irá fornecer todos os detalhes mecanicista, mas quando combinado com os resultados publicados a partir de outros modelos, 3-D culturas tornam-se um modelo alternativo adicional valioso para melhorar a nossa compreensão da doença relacionados com mecanismos, que podem ter um enorme potencial para o desenvolvimento de novos produtos e procedimentos no diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças infecciosas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD Biosciences	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD Biosciences	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher Scientific	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140