Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

Summary

Tradisjonell, todimensjonale cellekultur teknikker ofte resultere i endrede egenskaper med hensyn til differensiering markører, cytokiner og vekstfaktorer. Tredimensjonal cellekultur i den roterende cellekultur system (RCCS) gjenoppretter uttrykk for mange av disse faktorene som vist her med en extravillous trophoblast cellelinje.

Abstract

Feltet av menneskelige trophoblast forskning hjelpemidler i å forstå det komplekse miljøet etablert i løpet placentation. På grunn av disse studiene, er menneskelig in vivo eksperimentering umulig. En kombinasjon av primær kulturer, eksplantering kulturer og trophoblast cellelinjer som ^en støtte for vår forståelse av invasjonen av livmorveggen ² og ombygging av livmor spiral arterier ^3,4 av extravillous trophoblast celler (EVTs), som er nødvendig for en vellykket etablering av svangerskapet. Til tross for vell av kunnskap gleaned fra slike modeller, er det akseptert at in vitro cellekultur modeller ved hjelp av EVT-lignende cellelinjene vise endres cellular egenskaper når sammenlignet med sine in vivo kolleger ^5,6. Celler dyrket i den roterende cellekultur system (RCCS) display morfologiske, fenotypisk og funksjonelle egenskaper EVT-lignende cellelinjene som nærmere etterligner differensiere i uTero EVTs, med økt uttrykk av gener mediere invasjon (f.eks matrix metalloproteinaser (MMPs)) og trophoblast differensiering ^7,8,9. Saint Georges Hospital placenta celle Line-4 (SGHPL-4) (vennlig donert av Dr. Guy Whitley og dr. Judith Cartwright) er en EVT-lignende cellelinje som ble brukt for testing i RCCS.

Utformingen av RCCS kultur fartøyet er basert på prinsippet om at organer og vev fungerer i en tredimensjonal (3D) miljø. På grunn av den dynamiske kulturen forholdene i fartøyet, herunder vilkår for fysiologisk relevante skjær, celler dyrket i tre dimensjoner skjemaet tilslag basert på naturlige cellulære tilhørighet og differensieres til organotypic vev-liknende forsamlinger ^10,11,12. Opprettholdelsen av et fluid bane gir en lav skjæring, lav turbulens miljø som ligner forholdene funnet in vivo. Sedimentasjon av dyrkede celler er motvirkes ved å justere rotasjonenHastigheten på RCCS å sikre en konstant fritt fall av celler. Gassutveksling skjer gjennom en permeabel hydrofob membran plassert på baksiden av bioreaktor. Som sine foreldre vev in vivo, RCCS dyrket cellene er i stand til å svare på kjemisk og molekylær gradienter i tre dimensjoner (dvs på sin apikale, basal og sideflatene) fordi de er dyrket på overflaten av porøse microcarrier perler. Når vokst som to-dimensjonale monolayers på tette flater som plast, er celler fratatt denne viktige kommunikasjonen på sitt basal overflaten. Følgelig, den romlige begrensninger pålagt av miljøet dypt påvirke hvordan cellene fornuft og dekode signalene fra omkringliggende mikromiljøet, og dermed innebærer en viktig rolle for 3-D miljø ^13.

Vi har brukt RCCS til ingeniør biologisk meningsfylt 3-D modeller av ulike menneskelige epitelvev ^7,14,15,16. Faktisk, mange tidligere rapporter har DEMonstrated at celler dyrket i RCCS kan anta fysiologisk relevante fenotyper som ikke har vært mulig med andre modeller ^10,17-21. I sammendraget, representerer kulturen i RCCS en enkel, reproduserbar, high-throughput plattform som gir et stort antall differensierte celler som er mottagelig for en rekke eksperimentelle manipulasjoner. I det følgende protokoll, bruke EVTs som et eksempel, vi tydelig beskriver trinnene som kreves for å tredimensjonalt kultur tilhenger celler i RCCS.

Protocol

1. Kollagen Bead Forberedelse

1. Før lasting EVTs for 3-D cellekultur, må man forberede Cytodex-3 microcarrier perler:
   1. Vei opp riktig mengde Cytodex-3 perler kreves for forsøket. Denne protokollen er tilrettelagt for 10ml RCCS fartøy, der 0.05g av perler er nødvendig. For en 50ml RCCS fartøy, skala tilsvarende. I en 50ml autoklaverbar konisk tube, bland 250 mg Cytodex-3 perler med 12ml Dulbecco fosfatbufret løsning (DPBS). Dette beløpet er tilstrekkelig for 5 RCCS fartøy.
2. Sørg for tilstrekkelig volum er til stede i den koniske rør, som autoklaven prosessen vil resultere i fordampning. Løst cap røret og autoklav i 10 min ved 110 ° C.
3. Ta den koniske røret ved avslutningen av autoklaven syklusen og la Cytodex-3 perle løsningen avkjøles.
4. Etter at koniske røret er avkjølt til romtemperatur, bruk steril teknikk for å bringe det totale volumet til 12.5mL bruke 1X DPBS.
5. Cap og lagre forberedt Cytodex-3 perler ved romtemperatur. La forberedt perler å hovne opp og avkjøl til romtemperatur før bruk. Ovennevnte utarbeidelse av Cytodex-3 perler vil gi for fem 10ml RCCS fartøy. Vi har observert at utvidet lagring av Cytodex-3 perler ved romtemperatur vil resultere i redusert ytelse, som collagen vil destabilisere etter ca en måned. Cytodex-3 perler varierer i størrelse 133-215 mikrometer.

2. Media Forberedelse

1. Forbered 1L av RCCS optimalisert GTSF-2-medier (tilpasset fra ^22), som består av 40% MEM alfa, samt kosttilskudd og 60% L-15 Leibovitz media (tilpasset fra ^22). Først forberede 400ML i totalt volum på MEM alfa supplert med:
   21.2mM natriumbikarbonat
   0,06% Pepton
   0.7mm Fruktose
   1.4mm Galaktose
   5.6mM Glukose
   1% HEPES
   1% L-glutamin
   0,5% DETS
   10% FBS

2. For å forberede en stamløsning av ITS, oppløses i 5 ml sterilt forsurede H ₂ O utarbeidet av tilsetning av iseddik (ca. 0.05mL). Swirl å oppløse, følg med 45mL sterilt vann.
3. Vei ut nok L-15 Leibovitz er pulver for 600ml av medium ved å løse opp i vev-kulturen grade H ₂ O.
4. Ta det totale volumet av cellekultur medium til 1L med L-15 Leibovitz er medium. Filter-sterilisere og oppbevar ved 4 ° C i mørket. Tilsett 1% Penicillin-Streptomycin individuelt til hver delmengde av medium som brukes.
5. Mange medier formuleringer enn GTSF-2-medier har blitt testet i RCCS. Individuelle laboratorier må selv bestemme hvilke medium er optimal for eksperimentet utføres.

3. Celler og Bead Inkubasjon

1. Utbre EVTs til ~ 80% confluency, trypsinize og telle med aksepterte cellekultur praksis.
2. Suspend 1x10 ⁶ EVTs i 4ml av varmted media.
3. Bland forsiktig forberedt Cytodex-3 perler. Ved hjelp av sterile teknikker, fjerne 2,5 ml med preparerte perler bruke et bredt spissen, 10ml serologiske pipette og overfør til en ubrukt 15ml konisk tube. Merk at det kan være et lite tap av perler som de fester seg til pipetten.
4. La Cytodex-3 perler å bosette seg på bunnen av røret. Etter sedimentering, bruke en pipette til å fjerne det øverste laget av DPBS uten å forstyrre Cytodex-3 perler.
5. Bland 1x10 ⁶ forberedt EVTs i media med forberedt Cytodex-3 perler.
6. Inkuber celle-perle blandingen ved romtemperatur i 30 min. Periodisk bland forsiktig. Inkuber i ytterligere 30 min ved 37 ° C og 5% CO _2. Periodisk bland forsiktig.

Fire. Laster RWV

1. I en laminær kabinett, fjerne en 10ml RCCS av emballasjen og legg den i et sterilt, 6-brønn kultur plate for stabilitet. Se figur 1 for en merket diagram av RCCS.
2. Ta den store proppen fra havnen.
3. Ta det totale volumet av incubating celle-perle blandingen til 10ml med varmet media.
4. Legg celle / bead-blandingen i RCCS gjennom de store porten. Den RCCS bør være skråstilt i 45 ° vinkel (stor port opp) ved lasting hjelp til å fjerne eventuelle luftbobler. Hindre oppbygging av overtrykk ved å fylle skipet sakte og jevnt.
5. Erstatt stopper i den store porten.
6. Ta stemplene fra 3-ml sprøyter og plassere den tomme sprøytene på små porter. Legg til 1-3 ml av media til hver sprøyte. Sakte åpner to ventiler. Bytt sprøyten stemplene på sprøytene forsiktig. Legg til media fra en sprøyte før alle bobler er fjernet fra innsiden kammeret.
7. Plukk opp RCCS og banke forsiktig på side mens du roterer den foran deg til å se etter bobler. Hvis det er noen bobler, må du få dem ut av kammeret, som luftbobler vil forstyrre dannelsen of celle aggregater og introdusere skjærkrefter. Fjern bobler ved å rotere RCCS til boblene er under den lille havnen. Så skyv forsiktig nedover på sprøyten på motsatt side for å tvinge boblene i porten og ut av kammeret.
8. Lukk den ene siden port. Trykk forsiktig ned på den andre sprøyte stempel å introdusere en liten mengde positivt trykk inn i fartøyet, som forhindrer bobler fra forming. Lukk andre ventilen.
9. Legg RCCS på rotoren. Start rotasjon på 19rpm i en 37 ° C CO ₂ inkubator.

5. Endre Media

1. Endre media annenhver dag for de tre første dager, deretter hver dag etterpå.
2. Slå av rotoren og fjern RCCS. Trekk stempler opp for å skape noe sug, fjerne sprøytene fra hver liten havn og plassere RCCS på en vinkel slik at perlene bosette motsatte av den store porten.
3. Etter perlene har alle lagt seg, åpne en av de små ventiler ogtillate at media å strømme ut av RCCS og inn i en avfallsbeholder. Ta 2 / 3 av media på denne måten. Pass på å ikke forstyrre perler og å ikke kaste noen aggregater.
4. Lukk den lille ventilen og åpne den store porten. Legg media tilbake i RCCS gjennom den store porten. Erstatt stopper i den store porten.
5. Gjenta trinn 04.06 til 04.09.
6. Som aggregatene øker i størrelse, må du øke turtallet for å holde dem i suspensjon til alle tider, helst i en liten sirkulasjons mønster ved optimal hastighet. Vanligvis øker hastigheten mellom 0,3 til 0.7 rpm etter hver fôring gang aggregatene begynner å vokse synlig.

Seks. Samle spredd Cells

1. Fjern RCCS fra rotoren. Fjern sprøytene fra hver liten havn og plassere RCCS på en vinkel slik at perler kan bosette motsatte av den store porten.
2. Etter perlene har alle lagt seg, åpne en av de små ventiler og la media å strømme utav RCCS og inn i en avfallsbeholder. Fjern 1 / 3 av media på denne måten.
3. Lukk den lille ventilen og åpne den store porten. Forsiktig virvel fartøyet å spre aggregatene tilbake til løsning. Tomme flytende blandingen i en steril 50 ml konisk tube. La innsamlede aggregatene å bosette seg i den koniske røret før bruk supernatanten å grundig vaske kultur fartøy å maksimere utvinningen av aggregater. Aggregatene kan brukes til nedstrøms analyser umiddelbart, slik som flowcytometri, invasjon analyser, immunfluorescens og andre.

7. Representant Resultater

Et eksempel på EVT-lignende celler (SGHPL-4 trophoblast cellelinje) dyrket i RCCS på Cytodex-3 perler er vist i figur 2. Den EVT-like cellelinje viser prognoser som strekker seg vekk fra den største klyngen og feste til nabolandet klynger. Mange av perlene er helt dekket med spre celler. Når fjernet fra RCCS og plated på en ekstracellulær matrix, det EVT-som 3-D dyrket cellene aggressivt invadere og / eller migrere (figur 3). RT-PCR data bekrefter økt uttrykk av MMPs sett i 3-D tilslag i motsetning til tradisjonelle cellekultur monolayers (figur 4). Interessant, er gener ikke assosiert med invasjon også oppregulert i RCCS (Tabell 1) og kan hjelpe for å kartlegge områder som immun interaksjoner med invaderende trophoblasts celler.

Figur 1. Cartoon skildring av den roterende Cell Culture System (RCCS).

Figur 2. Fase kontrast micrograph av en representant samlet etter 5 dager vekst i et RCCS. Pilene viser invaderende cellene og * betegner Cytodex-3 microcarrier perler.

Figur 3. RCCS Grown tilslag var innebygd i fibrin geler. Invasion gjennom fibrin gel ble observert så tidlig som (A) 24 timer etter at fibrin embedding og (B) fortsatte gjennom 48 timer. Pilene viser invaderende cellene og * betegner Cytodex-3 microcarrier perler (tilrettelagt med tillatelse fra Ref. 7).

Figur 4. Comparative gelatin zymogram av monolayer og RCCS dyrket SGHPL-4 EVT-lignende celler. Pro-og aktive former av MMP-2 og MMP-9 ble utskilt av RCCS vokst trophoblast celler (tilrettelagt med tillatelse fra Ref. 7).

Tabell 1. Oppsummering av microarray resultater fra SGHPL-4 celler dyrket i et RCCS (tilrettelagt med tillatelse fra Ref. 7).

1. Indikerer gener som var under deteksjonsgrensen i monolayers.

Discussion

Kulturen teknikken som presenteres her gir etterforskere med svært invasiv EVT-lignende celler. Det har nå blitt anerkjent som et tap av differensiering skjer i monolayers grunn av hemming av cellulære responser på kjemiske og molekylære signaler i tre dimensjoner (apikale, basal og lateral celleoverflaten) ^10,13. Denne teknikken reflekterer kjennetegn bemerket i utero på invaderende EVT celler. Som prosedyren etterligner konvensjonelle monolayer vev kultur tid kinetikk, men gir celler med differensial uttrykk, kan sammenlignende analyser benyttes. Cell klynger kan høstes for bruk i eksperimenter som helst. De kan brukes som klynger eller kollagen degradering kan brukes for å isolere celler som enkle cellesuspensjon. Den Cytodex-3 microcarrier perler kan erstattes med stillaser eller microcarrier perler belagt med andre ekstracellulære matriser (ECMS) som kan være bedre til rette for individuelle laboratorier spesifikke interesser. Alternatively, det er mange andre 3-D kultur plattformer som kan være mer bidrar til spesifikke celletype kultur forholdene, som cellekultur inserts og spinner kolber ^10,23. Det bør bemerkes at kulturen kinetikk kan bli annerledes under disse omstendigheter, og bør etableres individuelt. Kultur kinetikk kan lett testet for ved å fjerne prøver fra RCCS med jevne mellomrom og analysere for uttrykk av særegne differensiering markører, spredning, og levedyktighet ^15. Optimal spredning og differensiering kinetikk kan påvises ved å sammenligne resultater over tid og mot konvensjonelle monolayer vev kultur teknikker. Bruke SGHPL-4 celler som et eksempel, var aggregater fjernet daglig og farget med Ki67 (for å bestemme spredning) og caspase-3 (for å bestemme apoptose), markører spesifikke for den enkelte laboratorier interesser kan lett byttes. Teknikken er beskrevet her kan brukes til studiet av spiral arterieremodeling, grunne implantasjon, og mors immunresponser mot invaderende trophoblasts celler.

Som det har blitt publisert tidligere, kan dette 3-D cellekultur modellen også brukes til en rekke andre cellelinjer ^17,14-21. I hvert fall har nytten av modellen til å bli testet av en rekke kjente differensiering markører. Som enhver in vitro cellekultur modell, 3-D cellekulturer er iboende reduksjonistiske. Ingen enkelt kultur modell vil gi alle mekanistisk detaljene, men da kombinert med publiserte resultater fra andre modeller, 3-D kulturer bli en ekstra verdifullt alternativ modell for å bedre vår forståelse av sykdomsrelaterte mekanismer, som kan holde et enormt potensiale for utvikling av nye produkter og prosedyrer i diagnostisering, forebygging og behandling av smittsomme sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD Biosciences	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD Biosciences	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher Scientific	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140