Summary
En ny och mycket effektiv i två steg affinitetskromatografi protokoll som har utvecklats och beskrivs i detalj. Metoden bygger på en liten rening tag med två inneboende tillhörighet och gäller ett brett spektrum av målproteiner med olika egenskaper.
Abstract
På grund av de höga kostnaderna i samband med rening av rekombinanta proteiner protokollen måste rationaliseras. För hög genomströmning ansträngningar finns det en efterfrågan på generella metoder som inte kräver målprotein specifika optimering 1. För att uppnå detta är rening taggar som genetiskt kan förenas med den gen av intresse vanliga 2. Den mest använda affinitet handtaget är hexa-histidin-tagg, som är lämplig för rening under både infödda och denaturering villkor 3. Den metabolisk belastning för att producera taggen är låg, men det ger inte så hög specificitet som konkurrerande affinitetskromatografi strategier 1,2.
Här, en bispecific rening tag med två olika bindningsställen på en 46 aminosyra har litet protein domänen utvecklats. Det albumin-bindande domän kommer från Streptokocker protein G och har en stark inneboende affinitet till humant serumalbumin(HSA). Elva yta exponerad aminosyror, inte deltar i albumin-bindande 4, var genetiskt randomiserades för att producera en kombinatoriska bibliotek. Proteinet bibliotek med romanen slumpmässigt ordnade bindande yta (figur 1) uttrycktes på fag partiklar för att underlätta val av bindemedel med phage display teknik. Genom flera omgångar Biopanning mot en dimeriskt Z-domänen från Staphylococcal protein A 5, en liten, bispecific molekyl med affinitet för både HSA och romanen målet identifierades 6.
Romanen protein domän, kallad ABDz1, bedömdes som ett rening tagg för ett urval av målproteiner med olika molekylvikt, löslighet och isoelektriska punkt. Tre målproteiner uttrycktes i Escherishia coli med romanen taggen smält till deras N-Termini och därefter affinitetsrenad. De första rening på antingen en kolumn med orörlig HSA eller Z-domän resulterade i relatitivt rena produkter. Två-stegs affinitet rening med bispecific taggen resulterade i tydliga förbättringar av protein renhet. Kromatografiska media med Z-domänen orörlig, till exempel MabSelect Visst, är lätt tillgängliga för rening av antikroppar och HSA kan enkelt kemiskt kopplas till media för att ge den andra matrisen.
Denna metod är särskilt fördelaktigt när det finns en stor efterfrågan på renhet av det återvunna målprotein. Den bifunctionality av taggen kan två olika kromatografiska steg för att användas när den metaboliska belastningen på uttrycket värd är begränsad på grund av den begränsade storleken på taggen. Det ger ett konkurrenskraftigt alternativ till så kallade kombinatoriska tagga där flera taggar används i kombination 1,7.
Protocol
1. Kloning av gene/ABDz1-tagged målet fusion konstruera
- Förbered PCR-fragment av ABDz1 genen flankerad av lämpliga restriktioner platser för N-terminal ligation av målgenen i uttrycket plasmiden (en plasmid som innehåller ABDz1 är fritt tillgängligt genom ett material överlåtelseavtal).
- Cleave renat uttryck vektor och PCR-fragmenten med utvalda restriktionsenzym i en lämplig reaktion buffert. Rena produkter innan ligatur.
- Ligate den begränsade ABDz1 fragmentet i uttrycket vektor som innehåller genen av intresse och förvandla ligering produkten till E. coli (i den ursprungliga metoden RR1ΔM15 stammen användes 8). Sprid omvandlas celler på agarplattor kompletteras med lämpliga antibiotika för urvalet.
- PCR-skärmen några kolonier och sekvens kontrollera den resulterande uttrycket kassett med DNA-sekvensering.
- Förbered plasmid från en övernattning kultur av en sekvens verifIED koloni och omvandla till önskad uttryck stam (i den ursprungliga metoden E. coli Rosetta (DE3), värd för en pRARE plasmid att förbättra produktionen av proteiner som kodas av mänskliga gener, har använts).
2. Protein expression
- Inokulera en enda bakterie koloni i 10 ml Tryptic soja buljong kompletteras med 5 g / l jästextrakt och lämplig antibiotika. Inkubera vid 150 rpm vid 37 ° C över natten.
- Inokulera 1 ml natten kultur i 100 ml färskt medium och framkalla proteinuttryck (ursprungligen 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside när en lac operon var utnyttjat) när cellerna når den logaritmiska tillväxtfas.
- Inkubera vid 150 rpm vid 25 ° C över natten och skörda celler genom centrifugering.
3. Ortogonal affinitet rening
- Suspendera pelleten i 25 ml löpande buffert (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) och störa the cellerna genom ultraljudsbehandling vid 60% amplitud och 1.0/1.0 pulser i 3 min. Centrifugera provet och filtrera målprotein som innehåller supernatanten (0,45 mikrometer) innan ytterligare rening.
- Jämvikt antingen en 1 ml HSA Sepharose kolonn eller en NHS-aktiverad kolumnen tidigare tillsammans med HSA enligt leverantörens rekommendationer, med 10 kolumn volymer (CV) för att köra buffert på 1 ml / min på ett lämpligt protein reningssystem. Ladda bakteriell lysat vid 0,5 ml / min och sedan återställa flödet till 1 ml / min.
- Tvätta kolonnen med 5 CV löpande buffert följt av 5 CV tvätt buffert (5 mm NH 4 Ac, pH 5,5).
- Eluera provet med elueringen buffert (0,5 M HAc, pH 2,5) vid 1 ml / min och samla fraktioner, övervaka absorption vid 280 nm för att välja fraktioner från elueras toppen för ytterligare rening.
- Pool i bråk med den högsta proteinkoncentration, späd två gånger i Sure löpande buffert (20 mM fosfatbuffert, 150 mM NaCl, pH 7,2) ochSe till att pH-värdet är runt neutral. Tillsätt 1 M Tris-HCl pH 8 för att öka pH-värdet vid behov.
- Ladda provet vid 0,5 ml / min på en 1 ml HiTrap MabSelect Visst kolumn som har jämvikt med 10 CV Visst löpande buffert på 1 ml / min. Återställ flödet till 1 ml / min efter lastning.
- Tvätta kolonnen med 5 CV Visst löpande buffert (steg 5) och eluera proteiner med 0,2 M HAc, pH 2,7. För känsliga målprotein eluatet kan neutraliseras direkt i samband med hämtning genom tillsats av Tris-HCl.
Om det kromatografiska steg är omvända eluatet från MabSelect Visst kolumn kan spädas ut i rinnande buffert (steg 3,1) och pH ökat till ca 8 genom tillsats av 1 M Tris-HCl. I allmänhet är smalare toppar observerats när Visst matrisen är anställd i det andra steget.
4. Utvärdering av renhetsgrad av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)
- Ladda renas bråk på enminska SDS-PAGE och om så önskas, analysera den molekylära vikten av det renade produkten genom masspektrometri. Det är viktigt att helt få bort provet eftersom en fri cystein i ABDz1 kan orsaka dimerization av den produkt som icke-reducerande förhållanden.
5. Representativa resultat:
Som ett bevis på princip var ortogonala affinitet rening underlättas av ABDz1 taggen utvärderas för tre mänskliga målproteiner som representerar olika löslighet klasser, molekylvikt och isoelektriska poäng (tabell 1). Den ABDz1 genen genetiskt var smält till målet gener och konstruktioner uttrycktes i E. coli, visar Figur 2 ett flödesschema för alla steg i metoden i följd. Efter rening av ortogonala protokollet, var prover som tagits vid olika tidpunkter analyseras med SDS-PAGE (Figur 3). Resultaten visar tydligt nyttan av en dubbel tagg och två mycket specifika steg rening. Även om en rimlig renhet är achieved efter det första reningssteget sett från gel, ger den successiva steg en mycket ren produkt som lämpar sig väl för krävande applikationer.
Figur 1. Konstruktion av kombinatoriska bibliotek som används för val av bispecific ABDz1 taggen.
Den 46 aminosyror albumin-bindande domän viks ihop till ett stabilt tre helix bunt och den innehåller ett bindningsställe för humant serumalbumin huvudsakligen förlagd till den andra spiralen. Genom att genetiskt randomisera elva yta som exponeras aminosyror som finns i den första och tredje helix, var ett nytt bindande yta konstruerad. De elva positioner anges i figuren och numreras enligt Kraulis et al. 9. Efter Biopanning mot en dimer av Z-domänen för Staphylococcal protein A med kombinatoriska bibliotek uttryckt på fag var bispecific ABDz1 molekylen identifieras.
Figur 2. Ett förenklat flödesschema för ortogonala affinitet rening protokollet.
En PCR-fragment som innehåller ABDz1 sekvensen knyts ihop (N-terminalt) med en gen av intresse i en lämplig uttryck vektor. Den ligatur Produkten förvandlas till E. coli för sekvens verifiering och plasmid förberedelser. Efter omvandlingen till ett uttryck värd, är en storskalig kultur för rekombinant protein uttryck som upp från en första natten kultur. Bakterier skördas genom centrifugering och lyseras av ultraljudsbehandling för att producera bakteriell lysat innehåller målprotein. Efter filtrering steg för att avlägsna rester av fasta partiklar, är lysat utsätts för ortogonala affinitet rening på ett flytande system för hantering genom att genomgå två reningssteg i följd. Elueras toppar från båda reningssteg mäts och utvärderas av SDS-PAGE för att bedöma renhet och i jämförelse med tHan lysat före reningen.
Figur 3. SDS-PAGE analys av målproteiner uttryckt och renat i fusion med ABDz1.
Prover tas från bakteriella lysat av tre proteiner som uttrycks i fusion till ABDz1, som representerar olika egenskaper, och ABDz1 taggen själv har samlats tillsammans med prover från motsvarande toppar från rening på en HSA-kolumnen och följas av en MabSelect Sure-kolumnen (A) . Lanes 1-4 representerar prover från lysates före reningen, gränderna 5-8 från HSA-reningen (första steget) och gränder 9-12 från MabSelect Visst reningen (andra steget). Prover laddas i följande ordning: ABDz1-141.377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 och ABDz1. Dessutom togs prover förvärvades från samma lysates renas i omvänd ordning på samma kolumner analyseras (B). Lanes 1-3 representerar prover från lysates före reningen, körfält 4-6 fROM MabSelect Sure-rening (första steget) och gränder 7-9 från HSA-rening (andra steget). Prover lastades i samma ordning som i (A) men taggen i sig ingår inte. Från dessa resultat är det tydligt att detta i två steg metod ger högt renade proteiner oavsett i vilken ordning stegen tillämpas.
| Namn B | Målprotein Uniprot C | Molekylär vikt (kDa) | Löslighet Klass D | Molekylvikt av fusion produkt (kDa) | Isoelektrisk punkt fusion produkt |
| 141.377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8,5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4,9 |
| HT2375 | P00740 | 8,9 | 5 | 15,2 | 6,8 |
- Molekylvikt ABDz1 tag ensam är 6,3 kDa, isoelektriska punkt 6.7.
- Målprotein representerar en del av Uniprot protein.
- http://www.uniprot.org .
- Löslighet klass av protein fragment med N-terminal Hans 6 ABP 10.
Tabell 1. Målproteiner och produkter fusion med ABDz1 taggen en utvärderades i en proof of principle studie.
Tre unika mänskliga proteiner med olika molekylvikt, löslighet och isoelektriska punkten valdes för uttryck och rening av ortogonala affinitet strategi.
Discussion
Den ortogonala affinitet rening protokollet presenteras här möjliggör effektiv rening av ett brett spektrum av målproteiner. Genom att kombinera den inneboende bindningsställe av albumin-bindande domän med ett nytt bindande yta, var en liten bispecific protein tag utvecklas. Det är mycket enkelt att använda taggen eftersom det kan helt enkelt vara klonas och uttryckas i fusion till något protein av intresse i valfri uttryck vektor. Standardutrustning som finns i de flesta laboratorier kan användas för att i två steg proteinrening. Eftersom funktionen av ABDz1 taggen är beroende på korrekt vikning av domänen för att effektivt exponera sina två bindande ytorna är metoden begränsad till proteiner som uttrycks i löslig form och inte lämpar sig för reningar i denaturering villkor. Reduktionsmedel bör också undvikas eftersom de stör bindning av ABDz1 till Z-domänen på MabSelect Visst matrisen.
Ortogonal affinitet reningning ger ett användbart alternativ till traditionella metoder för att uppfylla kraven av renade proteiner i många krävande tillämpningar. Samtidigt eliminerar denna metod behovet av kombinatorisk taggning när olika renings-strategier används i följd. För applikationer som kräver en infödd målprotein, kan ett proteas klyvningsställe införas för att göra enzymatisk borttagning av ABDz1 taggen möjliga 11. Dessutom är ABDz1 taggen första bispecific liten och vek protein domän som hittills beskrivits. Det är unikt eftersom det ger en rening strategi som beror på två mål viss affinitet interaktioner. I framtiden skulle det vara intressant att utvidga detta koncept genom att utveckla nya bispecific taggar som bär nya bindande ytor som är kompatibla med lättillgänglig och billig kromatografiska hartser. Till exempel genom att ersätta aminosyror som ingår i albuminbindning med grundläggande rester, en tagg kompatibel med iom utbyte kromatografi kan uppnås. Ett liknande koncept har visat sig effektiv genom att ladda konstruktion av Z-domänen för att skapa taggar som kallas Z-syra 12 och Z grundläggande 13 kompatibel med anjon-och katjonbytet, respektive.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och Svenska Vetenskapsrådet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
