Summary
Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.
Abstract
Aufgrund der hohen Kosten, die mit Aufreinigung von rekombinanten Proteinen die Protokolle müssen rationalisiert werden verbunden. Für High-Throughput-Anstrengungen besteht eine Nachfrage nach allgemeinen Methoden, die keine Zielprotein spezifischen Optimierung 1. Um dies zu erreichen, sind Reinigung Tags, die genetisch mit dem Gen von Interesse fusioniert werden üblicherweise 2 verwendet. Die am weitesten verbreitete Affinität Griff ist der Hexa-Histidin-Tag, der geeignet für die Reinigung unter nativen und denaturierenden Bedingungen 3. Die metabolische Belastung für die Herstellung der tag ist gering, aber es funktioniert nicht so hohe Spezifität als konkurrierende Affinitätschromatographie Strategien 1,2 bereitzustellen.
Hier ein bispezifischer Reinigung tag mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen auf einem 46 Aminosäure, hat kleine Protein-Domäne entwickelt. Die Albumin-bindende Domäne von Streptokokken-Protein G abgeleitet und verfügt über eine starke inhärenten Affinität zu humanem Serumalbumin(HSA). Elf Oberflächen-exponierten Aminosäuren, nicht in albuminbindenden 4 genannten Aufgaben wurden genetisch randomisiert einer kombinatorischen Bibliothek zu erzeugen. Das Protein-Bibliothek mit dem Roman zufällig angeordnet bindende Oberfläche (Abbildung 1) wurde am Phagenpartikel ausgedrückt, um die Auswahl von Bindemitteln durch Phagen-Display-Technologie zu erleichtern. Durch mehrere Runden von Biopanning gegen ein dimeres Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A 5, ein kleines, bispezifische Molekül mit einer Affinität zu HSA und der Roman Ziel war 6 identifiziert abgeleitet.
Das neue Protein-Domäne, die so genannte ABDz1, wurde als eine Reinigung tag für eine Auswahl von Target-Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt bewertet. Drei Zielproteine wurden in Escherishia coli mit dem Roman tag fusioniert, um ihre N-Termini und danach affinitätsgereinigte ausgedrückt. Erste Reinigung entweder auf eine Säule mit immobilisiertem HSA oder Z-Domäne führte zu relatiVely reinen Produkten. Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung mit dem bispezifischen Tag führte zu einer deutlichen Verbesserung der Protein-Reinheit. Chromatographische Medien mit der Z-Domäne immobilisiert, zum Beispiel MabSelect Klar, sind leicht zugänglich für die Reinigung von Antikörpern und HSA kann leicht chemisch Medien gekoppelt werden, um die zweite Matrix liefern.
Diese Methode ist besonders vorteilhaft, wenn es eine hohe Nachfrage auf Reinheit des gewonnenen Zielprotein. Die Bifunktionalität der Tag können zwei verschiedene chromatographische Schritte verwendet werden, während die metabolische Belastung auf die Expression Host beschränkt ist aufgrund der geringen Größe des Tags. Es bietet eine wettbewerbsfähige Alternative zu so genannten kombinatorischen Tagging, wo mehrere Tags in Kombination 1,7 verwendet werden.
Protocol
1. Die Klonierung der Target gene/ABDz1-tagged Fusionskonstrukt
- Bereiten PCR Fragmente der ABDz1 Gen durch geeignete Restriktionsschnittstellen für N-terminale Ligation des Zielgens in das Expressionsplasmid (ein Plasmid, das ABDz1 ist frei verfügbar durch ein Material Transfer Agreement) flankiert.
- Cleave gereinigt Expressionsvektor und PCR-Fragmente mit ausgewählten Restriktionsenzymen in einem geeigneten Reaktions-Puffer. Purify die Produkte vor der Ligation.
- Ligieren des eingeschränkten ABDz1 Fragment in den Expressionsvektor mit dem Gen von Interesse und verwandeln das Ligationsprodukt zu E. coli (in der ursprünglichen Methode der RR1ΔM15 Stamm wurde 8 verwendet). Spread-transformierten Zellen auf Agarplatten mit geeigneten Antibiotika zur Auswahl ergänzt.
- PCR-Bildschirm ein paar Kolonien und die Sequenz überprüft die resultierende Expressionskassette durch DNA-Sequenzierung.
- Bereiten Sie aus einer Übernachtkultur einer Sequenz verif PlasmidIED Kolonie und zu transformieren, um die bevorzugte Ausdruck Dehnung (in der ursprünglichen Methode E. coli Rosetta (DE3), präsentiert ein PRARE Plasmid für die Produktion von Proteinen durch menschliche Gene kodiert zu verbessern, wurden verwendet).
2. Proteinexpression
- Impfen einer einzelnen Kolonie in 10 ml CASO-Bouillon mit 5 g / l Hefeextrakt und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubation bei 150 rpm bei 37 ° C über Nacht.
- Inoculate 1 ml der Übernacht-Kultur in 100 ml frisches Medium und induzieren Proteinexpression (ursprünglich 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid wenn ein lac-Operon verwendet wurde), wenn die Zellen der logarithmischen Wachstumsphase zu erreichen.
- Inkubation bei 150 rpm bei 25 ° C über Nacht und Ernte Zellen durch Zentrifugation.
3. Orthogonal Affinitätsreinigung
- Das Pellet in 25 ml Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) und stören the-Zellen durch Beschallung bei 60% Amplitude und 1.0/1.0 Impulse für 3 min. Zentrifugieren Sie die Probe und Filter das Zielprotein mit Überstand (0,45 um), bevor eine weitere Reinigung.
- Äquilibrieren entweder eine 1 ml HSA-Sepharose-Säule oder eine NHS-aktivierte Säule, die zuvor mit HSA nach den Empfehlungen des Lieferanten verbunden, mit 10 Säulenvolumen (CV) von Laufpuffer bei 1 ml / min auf einem geeigneten Proteinreinigung System. Laden Sie die Bakterienlysat bei 0,5 ml / min und setzen Sie dann die Durchflussmenge auf 1 ml / min.
- Die Säule wird mit 5 CV von Laufpuffer von 5 CV Waschpuffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5) folgten.
- Eluieren der Probe mit Elutionspuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) bei 1 ml / min und sammeln Fraktionen, Monitor-Absorption bei 280 nm, um Fraktionen aus der eluierte Peak zur weiteren Reinigung aus.
- Pool der Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration verdünnt zwei Mal in SuRe Laufpuffer (20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2) undsicherstellen, dass der pH-Wert liegt bei neutral. Add 1 M Tris-HCl pH 8 bis pH ggf. zu erhöhen.
- Legen Sie die Probe mit 0,5 ml / min auf einer 1 ml HiTrap MabSelect SuRe Spalte, die äquilibriert mit 10 CV von Sure Laufpuffer wurde auf 1 ml / min. Setzen Sie den Durchfluss auf 1 ml / min nach dem Laden.
- Die Säule wird mit 5 CV von Sure Laufpuffer (Schritt 5) und eluieren die Proteine mit 0,2 M HAc, pH 2,7. Für empfindliche Zielproteine das Eluat kann direkt bei der Abholung neutralisiert werden durch Zugabe von Tris-HCl.
Wenn die chromatographische Schritte des Eluats von der MabSelect umgekehrt sind sicher Spalte kann in Laufpuffer (Schritt 3,1) verdünnt und der pH-Wert erhöhte sich auf rund 8 durch Zugabe von 1 M Tris-HCl. Im Allgemeinen sind die schmaleren Peaks beobachtet, wenn die SuRe Matrix in der zweiten Stufe eingesetzt wird.
4. Evaluation der Reinheit durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
- Legen Sie die gereinigten Fraktionen auf einereduzierenden SDS-PAGE und, falls gewünscht, analysieren das Molekulargewicht des gereinigten Produktes durch Massenspektrometrie. Es ist wichtig, reduzieren Sie die Probe, da ein freies Cystein in ABDz1 kann Dimerisierung des Produktes unter nicht-reduzierenden Bedingungen verursachen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Als proof of principle, war orthogonal Affinitätsreinigung von der ABDz1 tag erleichtert für drei menschliche Zielproteine, die verschiedene Löslichkeit Klassen, Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten (Tabelle 1) ausgewertet. Die ABDz1 Gen gentechnisch war es, die Zielgene fusioniert und die Konstrukte wurden in E. coli exprimiert, zeigt Abbildung 2 ein Flussdiagramm für alle Schritte des Verfahrens nacheinander. Nach der Reinigung durch die orthogonal-Protokoll wurden die Proben an verschiedenen Punkten gesammelt durch SDS-PAGE (Abbildung 3) analysiert. Die Ergebnisse zeigen deutlich den Nutzen einer dualen Tag und zwei hochspezifische Reinigungsschritte. Obwohl angemessene Reinheit achieved nach der ersten Reinigungsstufe als aus den Gelen gesehen, ergibt sich die aufeinander folgenden Schritt ein sehr reines Produkt auch für anspruchsvolle Anwendungen geeignet.
Abbildung 1. Aufbau der kombinatorischen Bibliothek für die Auswahl des bispezifischen ABDz1 Tag verwendet.
Die 46 Aminosäuren Albumin-bindende Domäne faltet sich zu einer stabile Drei-Helix-Bündel, und es enthält eine Bindungsstelle für humanes Serumalbumin vor allem auf die zweite Helix liegt. Durch gentechnisch randomizing elf ausgesetzte Oberfläche Aminosäuren in der ersten und dritten Helix befindet, wurde eine neuartige bindende Oberfläche entwickelt. Die elf Positionen sind in der Abbildung gezeigt und nummeriert nach Kraulis et al. 9. Nach Biopanning gegen ein Dimer der Z-Domäne von Staphylokokken-Protein A mit der kombinatorischen Bibliothek auf Phagen exprimiert, die bispezifischen ABDz1 Molekül identifiziert wurde.
Abbildung 2. Ein vereinfachtes Flussdiagramm für die orthogonal Affinitätsreinigung Protokoll.
Ein PCR-Fragment, welches das ABDz1 Sequenz ligiert (N-terminal) mit einem Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Das Ligationsprodukt ist E. verwandelt coli für Sequenz-Verifikations-und Plasmid-Präparation. Nach der Transformation zu einem Ausdruck Host ist ein groß angelegtes Kultur für Expression rekombinanter Proteine aus einer ersten Nacht-Kultur gesetzt. Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und lysiert durch Beschallung zu Bakterienlysat mit dem Zielprotein zu produzieren. Nach einer Filtration, um restliche feste Partikel zu entfernen, wird das Lysat orthogonal Affinitätsreinigung auf einem Liquid-Handling-System durchläuft zwei Reinigungsschritten hintereinander unterzogen. Eluierten Peaks von beiden Reinigungsschritte werden abgetastet und ausgewertet durch SDS-PAGE auf Reinheit zu bewerten und im Vergleich zu ter Lysat vor der Reinigung.
Abbildung 3. SDS-PAGE-Analyse von Target-Proteinen exprimiert und gereinigt in Fusion mit ABDz1.
Die Proben aus dem bakteriellen Lysat aus drei Proteinen in Fusion mit ABDz1, die verschiedene Eigenschaften und die ABDz1 Tag selbst zur Kenntnis genommen wurden zusammen mit Proben aus den entsprechenden Peaks von Reinigung über eine HSA-Spalte durch eine MabSelect Sure-Spalte gefolgt gesammelt (A) . Spuren 1-4 repräsentieren Proben aus Lysaten vor der Reinigung, Spur 5-8 von der HSA-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 9-12 aus dem MabSelect SuRe Reinigung (zweiter Schritt). ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 und ABDz1: Die Proben sind in der folgenden Reihenfolge geladen. Darüber hinaus wurden die Proben aus dem gleichen Lysaten in umgekehrter Reihenfolge auf die gleichen Spalten gereinigt erworben analysiert (B). Bahnen 1-3 stellen Beispiele aus Lysaten vor der Reinigung, Spuren 4-6 from MabSelect Sure-Reinigung (erster Schritt) und Gassen 7-9 von HSA-Reinigung (zweiter Schritt). Die Proben wurden in der gleichen Reihenfolge wie in (A), aber der Tag selbst ist nicht im Lieferumfang enthalten geladen. Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, dass dieses zweistufige Verfahren hochreine Proteine liefert unabhängig von der Reihenfolge, in der die Schritte angewendet werden.
| Name b | Zielprotein UniProt c | Molecular Gewicht (kDa) | Löslichkeit Klasse d | Molekulargewicht der Fusion Produkt (kDa) | Isoelektrischen Punkt von Fusionsprodukt |
| 141377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8,5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4,9 |
| HT2375 | P00740 | 8,9 | 5 | 15,2 | 6,8 |
- Molekulargewicht von ABDz1 Tag allein ist 6,3 kDa, isoelektrischer Punkt 6.7.
- Zielprotein stellt einen Teil der UniProt Protein.
- http://www.uniprot.org .
- Löslichkeit Klasse von Protein-Fragment mit N-terminalen His 6 ABP 10.
Tabelle 1. Zielproteine und Fusion-Produkte mit ABDz1 Tag ein in einem Proof of Principle-Studie ausgewertet.
Drei einzigartige menschliche Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht, Löslichkeit und isoelektrischen Punkt wurden zur Expression und Reinigung durch die orthogonale Affinität Ansatz gewählt.
Discussion
Die orthogonale Affinitätsreinigung Protokoll hier vorgestellten ermöglicht eine effiziente Reinigung einer Vielzahl von Target-Proteinen. Durch die Kombination der inhärenten Bindungsstelle des Albumin-bindende Domäne mit einem neuartigen bindende Oberfläche wurde eine kleine bispezifische Protein-Tag entwickelt. Es ist sehr einfach mit dem Tag nutzen, da es einfach geklont werden kann und ausgedrückt in Fusion auf jedes Protein von Interesse in jeder gewünschten Expressionsvektor. Verfügbare Standardausstattung in den meisten Labors können für die Zwei-Schritt-Protein Reinigung eingesetzt werden. Da die Funktion des ABDz1 Tag hängt die korrekte Faltung der Domäne, effizient aufzudecken seinen zwei bindenden Oberflächen, ist die Methode, um Proteine in löslicher Form exprimiert begrenzt und nicht für Reinigungen unter denaturierenden Bedingungen geeignet. Reduktionsmittel sollten auch vermieden werden, da sie stören die Bindung von ABDz1 der Z-Domäne auf dem MabSelect SuRe Matrix.
Orthogonal-Affinität ReiniTION bietet eine sinnvolle Alternative zu herkömmlichen Methoden, um die Anforderungen von hoch gereinigten Proteinen in vielen anspruchsvollen Anwendungen gerecht zu werden. Gleichzeitig wird durch diese Methode die Notwendigkeit für die kombinatorische Tagging, wenn unterschiedliche Reinigungsverfahren Strategien in Folge verwendet werden. Für Anwendungen, die eine native Zielprotein kann eine Protease-Spaltstelle eingeführt, um die enzymatische Entfernung der ABDz1 Tag möglich 11 zu rendern. Darüber hinaus ist die ABDz1 Tag das erste bispezifische kleine und gefaltete Protein-Domain bisher beschriebenen. Es ist einzigartig, da es eine Reinigung Strategie, die auf zwei Zielgruppen spezifische Affinität Interaktionen hängt bietet. In Zukunft wäre es interessant, dieses Konzept durch die Entwicklung neuartiger bispezifischer Tags, die neue Bindung Oberflächen, die mit leicht verfügbar und preiswert Chromatographieharze sind, tragen zu erweitern. Zum Beispiel durch den Austausch der Aminosäuren in Albumin-Bindung beteiligt mit basischen Resten, ein Tag mit iauf Austausch-Chromatographie dürfte erreichbar sein. Ein ähnliches Konzept hat sich bewährt, um tags wie Z-Säure 12 und Z 13 kompatibel mit grundlegenden Anionen-und Kationenaustausch bekannt zu erzeugen, die jeweils durch Ladung Engineering der Z-Domäne.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch die Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Schwedischen Forschungsrat finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
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