Summary
소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.
Abstract
프로토콜은 합리해야 재조합 단백질의 정화와 관련된 높은 비용으로 인해. 높은 처리량 노력 타겟 단백질 특정 최적화 1 필요하지 않은 일반적인 방법에 대한 수요가있다. 이것을 달성하기 위해, 유전자의 관심 유전자에 융합 될 수있는 정화 태그는 일반적으로 2 사용됩니다. 가장 널리 사용되는 화성 처리 기본 및 denaturing 조건 하에서 3 모두 정화에 적합합니다 hexa - 히스티딘 태그입니다. 태그를 생산을위한 대사 부담이 낮은이지만, 경쟁 친화 크로마 토그래피 기반 전략 1,2 높은 특이성으로 제공하지 않습니다.
여기, 46 아미노산에 두 개의 서로 다른 바인딩 사이트 bispecific 정화 태그는, 작은 단백질 도메인이 개발되었습니다. 알부민 결합 도메인 구균 단백질 G에서 파생된 인간 혈청 알부민에 강한 고유의 친화력을 가지고있다(HSA). 일레븐 표면 노출 알부민 결합 사에 관여하지 아미노산, 조합 라이브러리를 생성하는 유전자 무작위를했다. 무작위로 결합 표면 (그림 1) 배열의 소설과 단백질 라이브러리는 파지 디스플레이 기술에 의해 바인더의 선택을 촉진하는 파지 입자에 표현했습니다. dimeric에 대한 biopanning의 여러 라운드를 통해 포도상 구균 단백질 5 HSA와 소설 대상을 6 밝혀졌으며 모두 친화력이있는 작은 bispecific 분자에서 파생된 Z - 도메인.
ABDz1로 불리는 소설 단백질 도메인, 다른 분자량, 용해도 및 isoelectric 포인트 대상 단백질의 선택에 대한 정화 태그로 평가되었다. 세 대상 단백질들은 N - 테르에 융합하고 이후 친화력이 정화 소설 태그 Escherishia 대장균으로 표현했다. 고정 HSA 또는 Z - 도메인 중 열을 초기 정화는 relati 결과vely 순수한 제품. bispecific 태그로 2 단계 친화 정화는 단백질 순도의 상당한 개선 결과. Z - 도메인 색층 미디어 확실히 예 MabSelect위한 고정화 항체의 정화를 위해 즉시 사용 가능하며 HSA 쉽게 화학적으로 두 번째 매트릭스를 제공하는 미디어에 결합하실 수 있습니다.
복구 대상 단백질의 순도에 대한 높은 수요가있을 때이 방법은 특히 유리한 것입니다. 표현 호스트의 신진 대사 부담이 태그의 작은 크기로 인해 제한되는 동안 태그의 bifunctionality는 두 가지 색층 단계가 사용할 수 있습니다. 그것은 여러 개의 태그를 조합하여 1,7에 사용 어디에 조합 태그라는 경쟁력있는 대안을 제공합니다.
Protocol
1. 대상 gene/ABDz1-tagged 융합의 복제가 구축
- 플라스미드 표현의 대상 유전자 (플라스미드 포함 ABDz1이 물질 전송 계약을 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다)의 N - 터미널 내고 적합한 제한 사이트에 둘러싸인 ABDz1 유전자의 PCR 단편을 준비합니다.
- 다니엘 정화 표현 벡터 및 적절한 반응 버퍼에서 선택한 제한 효소로 PCR 파편. 결합하기 전에 제품을 정화.
- 관심의 유전자를 포함하는 발현 벡터에 제한 ABDz1 조각 Ligate와 E로 내고 제품을 변환 대장균 (원래 메서드에 RR1ΔM15 변형이 8 사용되었습니다). 선택에 적합한 항생제로 보충 한천 플레이트에 변형 세포를 확산.
- PCR 화면 몇 식민지와 순서는 DNA 배열에 의해 결과 표현 카세트를 확인합니다.
- 순서 verif의 야간 문화 플라스미드 준비처음엔 식민지와 선호하는 표현 스트레인 (인간 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산을 향상시키기 위해 플라스미드 pRARE를 호스팅하는 로제 원래 방법 E. 대장균 (DE3)에 사용되었다)로 변환.
2. 단백질 표현
- 5g / L 효모 추출물과 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물의 10 ML에 하나의 박테리아 식민지의 예방. ° C 야간 37 150 rpm으로 품어.
- 100 ML 신선한 매체 숙박 문화의 한 ML을 예방하고 세포 로그 성장 단계에 도달했을 때 단백질 표현을 (LAC 오스 오 페론이 활용되었을 때 이소 프로필 - β - D - thiogalactoside 원래 1 ㎜) 유도.
- 원심 분리에 의해 ° C 야간 및 수확 세포 25 150 rpm으로 품어.
3. 직교 친화 정화
- 25 ML 실행 버퍼 (25 MM 트리스 - HCL, 200 MM NaCl, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.05 % (W / V) 십대 초반 20, 산도 8.0)에 펠렛을 Resuspend하고 일을 방해60 % 진폭 3 분 1.0/1.0 펄스에서 sonication하여 전자 세포. 샘플을 원심 더욱 정화하기 전에 뜨는을 (0.45 μm의)이있는 대상 단백질을 필터링합니다.
- 적당한 단백질 정제 시스템 1 ML / 분 버퍼를 실행하는 10 열 볼륨 (CV)와 이전에 공급자의 권고에 따라 HSA와 결합 중 1 ML HSA 세파 로스 칼럼이나 보건국 활성화 열을, 평형. 0.5 ML / 분 세균성 lysate를로드하고 다음 유량 1 ML / 분 재설정하십시오.
- 세척 버퍼 5 CV (5 MM NH 4 AC, 산도 5.5) 다음에 실행하는 버퍼의 5 CV와 컬럼을 씻으십시오.
- 1 ML / 분 용출 버퍼 (0.5 M HAC, 산도 2.5)와 함께 샘플을 Elute 더욱 정화를위한 eluted 정상에서 분수를 선택하는 280 nm의에서 모니터 흡수를 분수를 수집합니다.
- 최고의 단백질 농도와 풀 분수는 확실히 실행 버퍼에 두 번 희석 (20 MM 인산, 150 MM NaCl, 산도 7.2)와산도 주변 중립 있는지 확인하십시오. 산도 필요한 경우를 높이기 위해 1 M 트리스 - HCL pH를 8을 추가합니다.
- 1 ML / 분 물론 실행 버퍼의 10 이력서와 equilibrated되었습니다 1 ML의 HiTrap의 MabSelect 물론 열을 0.5 ML / 분 샘플을로드합니다. 1 ML / 로딩 후 분 흐름 속도를 재설정합니다.
- 물론 실행 버퍼 5 CV (5 단계)로 컬럼을 씻고 0.2 M HAC, 산도 2.7과 단백질을 elute. 민감한 대상 단백질에 대한 eluate는 트리스 - HCL를 추가하여 수령시 직접 무력화 수 있습니다.
색층 단계 MabSelect에서 eluate을 반대하는 경우에는 물론 열이 버퍼 (3.1 단계)을 실행에 희석하고 산도가 1 M 트리스 - HCL의 추가에 의해 주위에 8 증가 수 있습니다. 물론 매트릭스가 두 번째 단계에서 고용되었을 때 일반적으로 좁아 봉우리가 관찰됩니다.
4. 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (SDS - PAGE)에 의한 순도 평가
- 에서 정화 분수로드원하는 경우, 질량 분석법에 의한 정화 제품의 분자량을 분석한 다음, SDS - PAGE을 감소합니다. 그것은 ABDz1에서 무료 시스테인이 아닌 감소 조건에서 제품의 dimerization을 일으킬 수 있으므로 충분히 샘플을 줄이는 것이 중요합니다.
5. 대표 결과 :
원리의 증거로서, ABDz1 태그에 의해 용이 직교 친화 정화는 서로 다른 용해도 클래스, 분자 무게 및 isoelectric 포인트 (표 1)을 나타내는 세 인간의 목표 단백질에 대한 평가되었다. ABDz1 유전자가 유전자 대상 유전자에 융합되었고 구조가 E. 대장균으로 표현했고 그림 2는 연속적 방법의 모든 단계에 대한 플로우 차트를 보여줍니다. 직교 프로토콜에 의해 정화에 따라 다른 지점에서 수집된 샘플을 SDS - PAGE (그림 3)에 의해 분석되었다. 결과는 명확하게 듀얼 태그와 두 매우 구체적인 정화 단계의 유틸리티를 보여줍니다. 합리적인 순결은 AC하더라도로 젤에서 본 최초의 정화 단계 이후 hieved, 연속 단계는 물론 매우 까다로운 애플 리케이션에 적합한 매우 순수한 제품을 산출.
그림 1. bispecific ABDz1 태그의 선택에 사용되는 조합 도서관의 디자인.
46 아미노산 알부민 결합 도메인 안정적인 세 나선 번들로 폴드 그리고 그것은 주로 두 번째 나선형에있는 인간 혈청 알부민에 대한 구속력이 사이트가 포함되어 있습니다. 유전자 첫 번째와 세번째에 위치하고 나선 열한 표면에 노출된 아미노산을 randomizing함으로써, 소설 바인딩 표면은 설계되었습니다. 열한 위치는 그림에 표시된 및 Kraulis 외에 따라 번호가 9.되었습니다. 파지에 대한 표현 조합 도서관은, bispecific ABDz1 분자가 확인되었다 포도상 구균 단백질의 Z - 도메인의 이합체에 대한 biopanning 따라.
그림 2. 직교 친화 정화 프로토콜에 대한 단순 플로우 차트.
ABDz1 시퀀스를 포함하는 PCR - 단편은 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자와 (N - 말기) 출혈도 잡았 있습니다. 내고 제품은 E.으로 변환됩니다 순서 확인 및 플라스미드 준비 대장균. 표현 호스트로 변환 후, 재조합 단백질 표현을위한 대규모 문화는 초기 야간 문화에서 설정됩니다. 박테리아는 원심 분리에 의해 수확 및 대상 단백질을 포함하는 박테리아 lysate를 만들어 sonication하여 lysed 있습니다. 잔류 고체 입자를 제거하는 여과 단계 후, lysate는 연속 두 정화 단계를 진행하여 액체 처리 시스템에 직교 친화 정화를 받게됩니다. 모두 정화 단계에서 Eluted 봉우리는 샘플과 정결을 평가하기 위해 SDS - PAGE에 의해 평가하고 t에 비해 아르그는 정화하기 전에 lysate.
그림 3. 표명과 ABDz1과 융합의 정화 대상 단백질의 SDS - PAGE 분석.
다른 속성을 나타내는 ABDz1, 그리고 ABDz1 태그 자체 융합으로 표현 세 단백질의 세균성 lysate에서 가져온 샘플은 물론 열 MabSelect 다음 HSA - 열에 정화에서 해당 봉우리에서 샘플과 함께 수집된 (A) . 레인 1-4 9-12 MabSelect 물론 정화 (두 번째 단계)에서 정화, HSA - 정화의 차선 5-8 (첫 단계)와 골목길 전에 lysates에서 샘플을 나타냅니다. ABDz1 - 141377, ABDz1 - HT875, ABDz1 - HT2375과 ABDz1 : 샘플은 다음과 같은 순서로로드됩니다. 또한, 동일한 컬럼에 대한 역순으로 정화 같은 lysates로부터 얻은 샘플을 분석했다 (B). 레인은 정화, 차선 4-6 F 전에 lysates에서 샘플을 1-3 대표롬 MabSelect 진짜로 정화 (첫 단계)와 HSA - 정화 (두 번째 단계)에서 레인 7-9. 샘플은 (A)하지만 태그 자체가 포함되지 않은에서와 같은 순서로로드했습니다. 그 결과는이 두 단계 방법에 관계없이 단계가 적용되는 순서의 고도 정화 단백질을 산출 것이 분명하다.
| 이름 B | 대상 단백질 Uniprot C | 분자 중량 (kDa) | 용해도 클래스 D | 분자량 융합 제품의 (kDa) | Isoelectric 지점 융합 제품의 |
| 141,377 | B7Z315 | 17.4 | 4 | 23.7 | 8.5 |
| HT875 | P01040 | 10.8 | 3 | 17.1 | 4.9 |
| HT2375 | P00740 | 8.9 | 5 | 15.2 | 6.8 |
- 혼자 ABDz1 태그의 분자량 6.3 kDa, isoelectric 포인트 6.7입니다.
- 대상 단백질은 Uniprot 단백질의 일부를 나타냅니다.
- http://www.uniprot.org .
- N - 터미널과 단백질 조각 그의 6 ABP 10 용해도 클래스.
표 1. ABDz1 태그와 대상 단백질과 융합 제품은 원칙적으로 연구의 증거로 평가.
다양한 분자량, 용해도 및 isoelectric 포인트 세 가지 독특한 인간의 단백질은 직교 친화 방식에 의해 표현과 정화를 위해 선택되었습니다.
Discussion
여기에 제시 직교 친화 정화 프로토콜은 표적 단백질의 광범위한 효율적인 정화 수 있습니다. 소설 바인딩 표면과 알부민 결합 도메인의 고유 바인딩 사이트를 결합하여, 작은 bispecific 단백질 태그가 개발되었다. 그것이 단순히 어떤 선호하는 발현 벡터에 대한 관심의 단백질로 복제 및 융합 표현 할 수 있기 때문에 태그를 활용하는 것은 매우 간단합니다. 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 표준 장비는 두 단계 단백질 정화에 대한 고용 수 있습니다. ABDz1 태그의 기능을 효율적으로 두개의 바인딩 표면을 노출하기 위해 도메인의 올바른 접힘에 의존 때문에, 방법은 용해 형태로 표현 단백질로 제한하고 denaturing 조건 하에서 purifications 적합하지 않습니다. 그들은 MabSelect 물론 매트릭스에서 Z - 도메인에 ABDz1의 바인딩을 방해 이후 감소 요원도 피해야한다.
직교 친화 purifica기는 매우 여러 까다로운 응용 프로그램에서 단백질을 정제의 요구 사항을 충족하기 위해 전통적인 방법에 대한 유용한 대안을 제공합니다. 동시에,이 방법은 다른 정화 전략이 연속적으로 사용되는 조합 태그에 대한 필요가 없습니다. 기본 목표 단백질을 필요로하는 어플 리케이션의 경우, 프로 테아제의 절단 사이트는 가능한 ABDz1 태그 11 효소 제거를 렌더링 도입 수 있습니다. 또한 ABDz1 태그는 날짜 설명한 최초의 bispecific 중소 접힌 단백질 도메인이다. 그 두 대상 특정 친화 상호 작용에 따라 정화 전략을 제공하는 지 유일하다. 앞으로 그것은 쉽게 사용할 수 있으며 저렴한 색층 수지와 호환되는 새로운 바인딩 표면을 가지고 소설 bispecific 태그를 개발하여이 개념을 확장하는 흥미로운 것입니다. 예를 들어, 태그가 호환 기본 잔류물와 알부민 바인딩에 관련된 아미노산을 대체하여교환 크로마 토그래피에 도달 수 있습니다. 이와 유사한 개념은 각각 Z 산 12 음이온과 양이온 교환과 호환 Z 기본 13으로 알려진 태그를 생성하기 위해 Z - 도메인을 담당 엔지니어링에 의해 효과가 입증되었습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 Knut와 앨리스 발렌 버그 재단과 스웨덴 연구위원회에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
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