Summary
एक साधारण और सामान्य पुस्तिका peptoid संश्लेषण बुनियादी उपकरणों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों शामिल विधि उल्लिखित है, सक्षम करने peptoids आसानी से ज्यादातर प्रयोगशालाओं में संश्लेषित. संश्लेषण, शुद्धि एक amphiphilic peptoid 36mer के लक्षण वर्णन वर्णित है, के रूप में अत्यधिक आदेश दिया nanosheets में अपने आत्म विधानसभा के रूप में अच्छी तरह से.
Protocol
1. ठोस चरण Polypeptoids Submonomer संश्लेषण
ठोस चरण संश्लेषण (एसपीएस) एक आम अनुक्रम विशिष्ट biopolymers कदम वार synthesize करने के लिए प्रयोग किया जाता तकनीक, एक polymeric राल मनका के रूप में एक आभ्यांतरिक समर्थन ठोस पर सीधे है. उच्च पैदावार युग्मन और अतिरिक्त reactant हटाने के आसानी एसपीएस के प्रमुख लाभ कर रहे हैं. एक युग्मन राल की प्रतिक्रिया के बाद, अतिरिक्त अभिकर्मकों बस और सूखा मोती अगले प्रतिक्रिया कदम के लिए तैयार हो धो रहे हैं. अंतिम संश्लेषण प्रतिक्रिया के बाद, पूर्ण लंबाई oligomers राल से cleaved हैं और सामग्री समाधान के चरण आगे का अध्ययन किया जा सकता है है. यहाँ, हम एसपीएस विशिष्ट अनुक्रम peptoid पॉलिमर उत्पन्न प्रक्रिया अनुकूलन.
- सेटअप: पुस्तिका peptoid संश्लेषण के सभी चरणों का एक डिस्पोजेबल, (पीपी) polypropylene fritted कारतूस या एक fritted कांच प्रतिक्रिया एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के साथ सुसज्जित पोत में किया जा सकता है. एक धूआं हुड में सभी आपरेशनों का प्रदर्शन करना. जी में incubations के लिएलड़की पोत या प्लास्टिक कारतूस, एक नाइट्रोजन धीरे उचित मिश्रण के लिए समाधान बुलबुला आपूर्ति के लिए एक हाथ से कनेक्ट. वैकल्पिक रूप से, डिस्पोजेबल कारतूस में प्रतिक्रिया incubations के लिए, टोपियां और एक रोटरी प्रकार के बरतन पर जगह के साथ कारतूस के दोनों सिरों मुहर. प्रतिक्रिया मिश्रण या washes नाली, बर्बादी जाल के माध्यम से निर्वात घर से कनेक्ट. इस पोत के साथ एक मोटे मिलाना fritted होना चाहिए. कांच प्रतिक्रिया पोत Siliconize गिलास पोत की दीवारों से चिपके से मोती से बचने के लिए. Dichloroethane में 5% dichlorodimethylsilane (v / वी) के एक समाधान तैयार करें. Siliconizing समाधान के साथ शीर्ष पर एक साफ और सूखी प्रतिक्रिया पोत भरें, 30 मिनट के लिए बैठते हैं, तो नाली. पोत DCE के साथ एक बार धो तो एक बार मेथनॉल के साथ. siliconizing समाधान reused किया जा सकता है, तो इसे बचाया जाना चाहिए. या तो शुष्क हवा या बंद हिला किसी भी अतिरिक्त समाधान कांच के बने पदार्थ और पानी निकलने की टोंटी हटाने के बाद सूखी जब तक सेंकना. राल जोड़ने से पहले प्रतिक्रिया पोत कूल.
- रिंक एमाइड पुनः के 100 मिलीग्राम (0.06 mmol) जोड़ेंएक fritted प्रतिक्रिया पोत पाप. Dimethylformamide के 2 एमएल (DMF) जोड़कर राल पक्की. मिलाते हुए या 10 मिनट के लिए बुदबुदाती से घबरा देना. वैक्यूम द्वारा हल बढ़कर राल अलग नाली.
- 20% DMF में 4 methylpiperidine (v / v) की 1 एमएल जोड़ें Fmoc समूह deprotect. 2 मिनट और निकास के लिए घबरा देना. एक 12 मिनट ऊष्मायन के साथ दोहराएँ.
- DMF की 2 एमएल जोड़ने, 15 सेकंड के लिए आंदोलन है, और draining द्वारा राल कुल्ला. 3x दोहराएँ.
- Bromoacetylation: 0.6 DMF में एम bromoacetic एसिड (0.6 mmol) के 1 एमएल और एन के 86 μL, N'- diisopropylcarbodiimide (समकक्ष 0.93, 0.56 mmol) जोड़ें. 30 मिनट के लिए कोमल बुदबुदाती के साथ सेते हैं, तो नाली और DMF की 2 एमएल (4x दोहराने) से कुल्ला.
- विस्थापन: 1 एन methylpyrrolidinone में 1-2 एम amine एमएल जोड़ें. 30-120 मिनट के लिए बुदबुदाती साथ सेते हैं, तो नाली और DMF (4x 2 एमएल) के साथ कुल्ला.
- Submonomer चक्र, 1.5 (bromoacetylation) और 1.6 (displacemen कदम दोहरा द्वारा peptoid श्रृंखला बढ़ने के लिए जारी रखेंटी).
- अंतिम विस्थापन के बाद किया जाता है, DMF की 2 एमएल (4x दोहराने) से कुल्ला, तो dichloromethane की 2 एमएल (3x दोहराने). कैप और दरार जब तक प्रतिक्रिया पोत की दुकान.
- (वैकल्पिक) के संश्लेषण में रोकें: एक peptoid संश्लेषण के दौरान विरामित करने के लिए, विस्थापन प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए और चरण के लिए 1.8 के लिए जारी है. Peptoid श्रृंखला से बढ़ जारी रखने के लिए, फिर सूजन सूखे (1.2 कदम) राल और submonomer चक्र (1.5 और 1.6 कदम) दोहरा द्वारा संश्लेषण को पुनरारंभ करें. राल और सूख 2 विस्थापन को छोड़कर किसी भी विस्थापन के बाद संग्रहीत किया जा सकता है क्योंकि संयुग्म राल - peptoid एक चक्रीय diketopiperazine पक्ष उत्पाद के रूप में हो सकता है.
- एकाधिक युगपत syntheses के लिए, एक ठोस चरण निष्कर्षण वैक्यूम कई गुना क्षमता को अधिकतम करने के लिए सिफारिश की है. Peptoid संश्लेषण भी ठीक से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Aapptec शीर्ष 396, CEM लिबर्टी माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र और प्रोटीन टेक्नो जैसे पेप्टाइड synthesizers, में तरीकों प्रोग्रामिंग द्वारा स्वचालित किया जा सकता हैlogies इंक प्रस्तावना सिंथेसाइज़र.
2. विखंडन और साइड चेन Deprotection
- एक 20 एमएल जगमगाहट गिलास शीशी सूखे राल के सभी स्थानांतरण.
- एक डाकू के अंदर काम करना और उचित व्यक्तिगत संरक्षा उपस्कर के उपयोग, जगमगाहट ग्लास शीशी और टोपी कसकर trifluoroacetic एसिड (TFA) दरार एक कॉकटेल (जैसे 95% aq TFA. चर्चा देखें) के 4 एमएल जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 से मिनट 2 घंटे के लिए हिलाओ (चर्चा देखें).
- एक डिस्पोजेबल, पीपी fritted कारतूस के माध्यम से एक नया, पूर्व वजन 20 एमएल जगमगाहट गिलास शीशी में राल फ़िल्टरिंग द्वारा TFA दरार समाधान लीजिए. एक डिस्पोजेबल, पीपी विंदुक दरार कॉकटेल समाधान हस्तांतरण करने के लिए सुविधाजनक है.
- राल कुल्ला और किसी भी अवशिष्ट peptoid इकट्ठा ताजा दरार कॉकटेल के 1 एमएल जोड़ें. 2x दोहराएँ.
- नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा उड़ाने द्वारा या एक Biotage V10 बाष्पीकरण का उपयोग करके TFA लुप्त हो जाना.
- 6 एमएल में कच्चे तेल Redissolveacetonitrile / पानी HPLC के लिए 01:01 (v / v). रुक और lyophilize. दोहराएँ.
- कच्चे उत्पाद के वजन रिकार्ड. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखे पाउडर के रूप में स्टोर
- टेस्ट दरार (वैकल्पिक): राल के 0.5% पर एक परीक्षण दरार करने के लिए जल्दी और संश्लेषित peptoid की शुद्धता बड़े पैमाने पर निर्धारित और कि क्या सही दरार शर्तों चुने गए प्रदर्शन किया जा सकता है. टेस्ट चोली विशेष रूप से संश्लेषण की प्रगति की निगरानी के लिए उपयोगी होते हैं.
3. Polypeptoid की विशेषता और शोधन
- विश्लेषणात्मक HPLC, electrospray LC-एमएस, और / या MALDI-TOF का एक संयोजन के माध्यम से, कच्चे उत्पाद की शुद्धता का निर्धारण और क्या वांछित आणविक भार मौजूद है.
- न्यूनतम acetonitrile विलेयता के लिए आवश्यक के रूप में के साथ एक ~ पानी में सूखी peptoid पाउडर के 5-10 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें. 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर कच्चे peptoid उत्पाद के स्पष्ट समाधान के लिए और धूल कणों को दूर.
- विश्लेषणात्मक एचPLC और electrospray LC-एमएस: ~ 20 μg / एमएल कच्चे peptoid समाधान तैयार करें. फ़िल्टर 0.45 सुक्ष्ममापी के साथ 200 μL फिल्टर और 20 μL इंजेक्षन.
- MALDI: मिक्स ~ 1 μL मैट्रिक्स के साथ 20 मिलीग्राम / एमएल peptoid 1 की μL. स्पॉट MALDI थाली पर एक μL और शुष्क हवा की अनुमति. मैट्रिक्स और अधिग्रहण मोड नमूना (5 छवि) पर निर्भर है.
- रिवर्स चरण HPLC प्रस्तुत करने के साथ कच्चे peptoid मिश्रण शुद्ध. ढाल और स्तंभ (C4 या C18) polypeptoid के hydrophobicity के आधार पर चुनें. कम्बाइन भिन्न शुद्ध, फ्रीज, और lyophilize, एक भुलक्कड़ सफेद पाउडर में जिसके परिणामस्वरूप. अंतिम उत्पाद का वजन रिकार्ड.
- एचसीएल नमक (वैकल्पिक) का गठन: न्यूनतम acetonitrile के साथ 100 मिमी एचसीएल (aq.) में lyophilized पाउडर Redissolve. पूर्व तौला गिलास शीशी पर स्थानांतरण. फ्रीज और फिर से lyophilize. 2x दोहराएँ. Peptoid पाउडर के बड़े पैमाने पर निर्धारित करने के लिए Reweigh.
4. Peptoid Nanosheet गठन
इस अनुभाग डेसएक एकल श्रृंखला, विशिष्ट अनुक्रम, amphiphilic 36 पूर्व peptoid (1 छवि) से चादरें फार्म प्रोटोकॉल cribes. बाद peptoid कतरा संश्लेषित है, शुद्ध है, और lyophilized रूप में ऊपर वर्णित है, परिणामस्वरूप सफेद पाउडर DMSO में भंग कर रहा है एक 2 मिमी स्टॉक समाधान बनाने.
- शीट गठन बफर में 20 सुक्ष्ममापी peptoid समाधान (10 Tris - एचसीएल मिमी, 100 मिमी NaCl, पानी में पीएच 8.0) एक 1 घूंट कांच की शीशी में 500 μL तैयार सबसे पहले, पानी मिल्ली - क्यू की μL 445, 10x शीट गठन बफर के 50 μL, और मिश्रण भंवर में जोड़ें. फिर, 2 मिमी peptoid स्टॉक समाधान के 5 μL और धीरे ज़ुल्फ़ समाधान जोड़ें. गिलास शीशी कैप.
- शीट्स पतला जलीय peptoid समाधान के कोमल आंदोलन से बनते हैं. धीरे धीरे झुकने ग्लास शीट में क्षैतिज स्थिति से ईमानदार स्थिति परिणाम के लिए शीशी. मिलाते कोमल चादरें भी पैदावार, तथापि, चादरें करने के लिए छोटे और कम सीधे किनारों के साथ हो जाते हैं. शीट गठन तंत्र की एक और अधिक गहन विश्लेषण reporte हैघ अलग. 2
- कई उच्च गुणवत्ता चादरें के लिए, क्षैतिज अक्ष के बारे में कांच की शीशियों धीरे (<1 आरपीएम) के एक से तीन दिन के लिए बारी बारी से. एक उपयुक्त तकनीकी संसाधन Rotamix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी RKVSD या एक स्वनिर्धारित घुमाव इस लगातार प्रदर्शन कर सकते हैं.
- Nanosheets के डायलिसिस (वैकल्पिक): कुछ अनुप्रयोगों में, यह आवश्यक हो किसी भी मुक्त peptoid चेन या buffers के लवण / हटाने कर सकते हैं. फ्लोट एक - Lyzer 15 मिनट के लिए वांछित बफर में 100 केडी झिल्ली भिगोएँ. नमूना कक्ष में 500 μL peptoid चादर समाधान लोड. वांछित बफर के 500 एमएल में भिगोएँ, 60 rpm पर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ क्रियाशीलता. चादरों की डायलिसिस 4 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें. हर घंटे विनिमय, बफर समाधान के एक ताजा स्टॉक के साथ.
5. Nanosheets के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- Nanosheets के प्रतिदीप्ति छवियों के साथ नील लाल, एक पर्यावरण संवेदनशील डाई प्रतिदीप्ति जिनकी तीव्रता बढ़ जाती है जब यह Hydr में स्थानीयकृत है imaged किया गयाophobic वातावरण (छवि 2).
- नील लाल का 1 सुक्ष्ममापी की अंतिम एकाग्रता प्राप्त nanosheet समाधान के 100 μL 100 सुक्ष्ममापी नील लाल का 1 μL जोड़ें.
- गर्म पानी में एक 1% agarose समाधान करें और एक प्लास्टिक पेट्री डिश में डाल देना. सुनिश्चित करें agarose समाधान लगभग 1 / 8 इंच मोटी है और समाधान एक सपाट सतह पर undisturbed शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. Agarose सेट के बाद, एक रंग का उपयोग कर में कटौती और 1 सेमी हस्तांतरण एक गिलास स्लाइड x 1 सेमी चौकों.
- उसी विमान, हाजिर agarose के टुकड़े पर चादर समाधान के 1 μL में चादरें इकट्ठा. Agarose 2 मिनट के लिए बफर अवशोषित करने के लिए, सतह पर चादरें छोड़ने की अनुमति दें. 15 मिनट के भीतर छवि, अन्यथा agarose निर्जलीकरण के कारण ख़राब शुरू हो जाएगा.
- समाधान में छवि चादरें करने के लिए, एक 20 मिमी व्यास एक गिलास स्लाइड पर 0.12 मिमी गैसकेट के अंदर 15 μL लोड. Coverslip के साथ कवर. यदि पत्रक बस एक पाल बांधने की रस्सी के बिना एक गिलास स्लाइड और coverslip के बीच sandwiched, कई चादरें वाईकरूँगा कतरनी और लगने मामूली वाष्पीकरण चादरें लगातार स्थानांतरित करने के लिए कारण होगा.
- Epifluorescence रोशनी (जैसे एक ओलिंप IX81 उल्टे एक Andor iXonEM + एक टेक्सास लाल फिल्टर के साथ EMCCD स्पेक्ट्रा के साथ फिट माइक्रोस्कोप) के तहत छवि चादरें.
6. स्कैन Nanosheets इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)
- सिलिकॉन सब्सट्रेट (वैकल्पिक) खोदना प्लाज्मा: सिलिकॉन चिप्स प्लाज्मा करने के लिए शीट की सोखना में सहायता etched हैं. एक प्लाज्मा क्लीनर निर्वात चैम्बर (जैसे Harrick प्लाज्मा क्लीनर / अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ PDC-32G) में सिलिकॉन चिप रखें. 200 mTorr करने के लिए नीचे पम्प और 18W (PDC-32G के लिए उच्च सेटिंग) आरएफ कुंडल सेट. 2 मिनट के लिए नक़्क़ाशी.
- प्लाज्मा का इलाज एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर peptoid शीट समाधान के 20 μL गिरा. 3 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें. के टिप के साथ अतिरिक्त समाधान निकालें किम - पोंछ. पिपेट सतह पर पानी की 20 μL और अतिरिक्त समाधान फिर से हटाने के लिए बफर और नमक निकालने. 4x दोहराएँ.
- वैकल्पिक रूप से डायल,पानी के खिलाफ peptoid चादर समाधान yze बफर और नमक निकालने. Dialyzed शीट समाधान के 20 μL प्लाज्मा इलाज सिलिकॉन substrates पर गिरा. एयर नमूना सूखी.
- एक लेंस डिटेक्टर के साथ और 1 केवी और केवी 5 (3 छवि) के बीच ऊर्जा बीम पर SEM (जैसे Zeiss मिथुन अल्ट्रा-55 विश्लेषणात्मक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप) के साथ छवि चादरें.
7. सुरक्षा नोट:
- Dimethylformamide और Dichloromethane यथोचित carcinogens संदिग्ध हैं.
- एन, N'Diisopropylcarbodiimide, 4 methylpiperdine और bromoacetic एसिड त्वचा, आंखों और श्वसन तंत्र के लिए खतरनाक हैं. वे देखभाल के साथ हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह विषाक्त हो सकता है अगर साँस या त्वचा के माध्यम से अवशोषित कर सकते हैं और जोखिम संवेदीकरण में परिणाम सकता है. खाली कंटेनर उत्पाद अवशेषों (/ तरल वाष्प) बनाए रखने और अच्छी तरह से उन्हें हुड से हटाने से पहले rinsed होना चाहिए.
- TFA एक मजबूत एसिड है, और अत्यंत ऊपरी श्वास पथ, आँखों के लिए विनाशकारी है, औरत्वचा. TFA भी हर समय हुड में TFA के केंद्रित समाधान अस्थिर रखने के लिए सांस की क्षति से बचने के. उचित पीपीई, और सावधानी का उपयोग करें जब TFA के समाधान से निपटने. बदलें दस्ताने तुरंत अगर वे TFA के साथ संपर्क में आते हैं, और तुरंत किसी भी फैल साफ.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
इस अनुभाग में, एक अनुक्रम विशेष 36 मेर peptoid श्रृंखला के संश्लेषण, लक्षण और शुद्धि का वर्णन है कि एक उच्च आदेश दिया nanosheet 3 (1 छवि) में सिलवटों.
ब्लॉक प्रभारी एच [NAE-एनपीई] 9 peptoid - [NCE - एनपीई] 9 राष्ट्रीय राजमार्ग 2 रिंक एमाइड राल के 100 मिलीग्राम पर संश्लेषित किया गया था. एक 2 एम amine समाधान सभी विस्थापन प्रतिक्रियाओं, जो 1-18 अवशेषों और 19-36 अवशेषों के लिए 120 मिनट के लिए 60 मिनट के लिए बाहर किए गए के लिए इस्तेमाल किया गया था. टी Butyl बीटा alanine एचसीएल मुक्त आधार (चर्चा देखने के) के लिए परिवर्तित कर दिया गया जबकि phenethylamine और BOC - ethylenediamine दोनों का इस्तेमाल किया directl थेवाई राल 95% TFA, 2.5% triispropylsilane, 2 घंटे के लिए 2.5% पानी के साथ cleaved किया गया था. TFA सुखाया था और जिसके परिणामस्वरूप चिपचिपा तेल (~ 180 मिलीग्राम) 6 एमएल acetonitrile में फिर से भंग: पानी 01:01 (v / v). उत्पाद (4 छवि) और शुद्धता और उत्पाद जन की उपस्थिति द्वारा पुष्टि की गई आरपी HPLC (पानी ढाल में 30-80% acetonitrile, दोनों 1 / एमएल मिनट 30 से अधिक मिनट पर 0.1% (v / v) TFA, युक्त विश्लेषणात्मक से पर 60 डिग्री सी के साथ एक C18, 5 सुक्ष्ममापी, 50 एक्स 2 मिमी स्तंभ) और MALDI (छवि 5).
रिवर्स चरण HPLC के साथ एक Vydac C18 स्तंभ (10 सुक्ष्ममापी, 22 मिमी x 250 मिमी) पर शोधन दीं, 10 एमएल / मिनट पर 60 मिनट से अधिक 0.1% TFA के साथ पानी में 30-60% acetonitrile की एक ढाल का उपयोग कर. स्तंभ प्रत्येक chromatographic चलाने के लिए कच्चे उत्पाद के 60 मिलीग्राम के साथ भरी हुई थी. शुद्ध भिन्न आर.पी. HPLC विश्लेषणात्मक (4 छवि) से शुद्धता के आधार पर संयुक्त थे और ~ एक भुलक्कड़ सफेद पाउडर के 80 मिलीग्राम उपज lyophilized .
शुद्ध ब्लॉक प्रभारी आणविक peptoidवजन MALDI द्वारा पुष्टि की गई. 1 100 acetonitrile में peptoid शुद्ध सुक्ष्ममापी की μL: पानी 01:01 (v / v) मैट्रिक्स के μL 1 (5 मिलीग्राम / एमएल acetonitrile में α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड के साथ मिलाया गया था: पानी 01:01 v / v और 0.1% TFA) और 1 μL MALDI प्लेट पर देखा गया था. एयर सूखे नमूना के बाद, यह एप्लाइड / Biosystem एमडीएस SCIEX 4800 MALDI TOF विश्लेषक / TOF में रखा गया था. अधिग्रहण और प्रसंस्करण मोड रैखिक कम द्रव्यमान थे. देरी समय के लिए स्वचालित रूप से समायोजित की गणना वजन लक्षित जन में प्रवेश किया था. लेजर की तीव्रता 3400 के लिए स्थापित किया गया था. मनाया बड़े पैमाने पर, 4981.2, जन 4981.74 की गणना करने के लिए बारीकी से मेल खाता है.
lyophilized शुद्ध पाउडर DMSO में भंग कर दिया गया था एक 2 मिमी स्टॉक समाधान ° जो 4 पर संग्रहीत किया जा सकता है सी. शीट्स aforementioned प्रोटोकॉल द्वारा तैयार किए गए और प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और SEM (छवि 2 और 3) के साथ imaged. सुविधा 300 सुक्ष्ममापी लेकर आकार के साथ आकार के एक किस्म मनाया रहे हैं और notably, सीधे किनारों प्रमुख हैं.
चित्रा 1 ब्लॉक प्रभारी peptoid एच [NAE-एनपीई] 9 अनुक्रम - [NCE - एनपीई] 2 9 राष्ट्रीय राजमार्ग. एक एकल श्रृंखला, ब्लॉक प्रभारी, amphiphilic polypeptoid 36 पूर्व स्वयं assembles में अत्यधिक आदेश दिया, दो आयामी 3 nanosheets. गणना आणविक भार 4,981.74 है.
चित्रा 2 peptoid nanosheets प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों. शीट्स एक 20 सुक्ष्ममापी 10 मिमी Tris, 100 मिमी NaCl, 8.0 पीएच में peptoid समाधान से गठन किया गया. शीट agarose पर 1μM नील लाल के साथ imaged थे. स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं.
चित्रा 3 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों.peptoid nanosheets. शीट्स एक 20 सुक्ष्ममापी 10 मिमी Tris, 100 मिमी NaCl, 8.0 पीएच में peptoid समाधान से गठन किया गया. स्केल सलाखों 5 सुक्ष्ममापी हैं.
चित्रा 4 विश्लेषणात्मक रिवर्स एच [NAE-एनपीई] 9 चरण HPLC का पता लगाने - [NCE - एनपीई] 2 9 राष्ट्रीय राजमार्ग. कच्चे तेल और शुद्ध विश्लेषणात्मक HPLC का पता लगाने (30-80% पर ढाल 30 मिनट से अधिक 1 एमएल / मिनट 60 ° C18, 5 सुक्ष्ममापी, x 50 मिमी 2 कॉलम के साथ सी) और कच्चे तेल की शुद्ध ब्लॉक प्रभारी एच [peptoid NAE-एनपीई 9] [NCE - एनपीई] 2 9 राष्ट्रीय राजमार्ग दिखाया गया है.
चित्रा 5 MALDI-TOF एच [NAE-एनपीई] 9 जन स्पेक्ट्रोस्कोपी का पता लगाने - [NCE - एनपीई] 2 9 राष्ट्रीय राजमार्ग. मनाया बड़े पैमाने पर, 4981.2, जन गणना, 4981.74 के करीब समझौते में है.
Discussion
अनुप्रयोगों और महत्व
इस प्रोटोकॉल peptoid संश्लेषण और peptoids की आत्म विधानसभा nanosheets में जलीय का एक सरल और कारगर तरीका वर्णन करता है. अधिकांश प्रयोगशालाओं को आसानी से peptoids synthesizing क्योंकि सस्ती सामग्री, बुनियादी विशेषज्ञता और सीधा तकनीक 4 का उपयोग कर रहे हैं करने में सक्षम हैं. इसी तरह, अति पतली, अत्यधिक आदेश दिया nanosheets की आत्म विधानसभा केवल दोहराया एक पतला जलीय peptoid 2 समाधान के झुकाव एक शीशी की आवश्यकता है. Peptoids जैव चिकित्सा और nanoscience अनुसंधान के लिए सामग्री का वादा कर रहे हैं क्योंकि कि वे मजबूत और synthetically का लचीला अभी तक अनुक्रम विशिष्ट और उच्च tunable 5 हैं. Peptoids पदानुक्रमित nanostructures के 3, 11-14 में जैविक (6,7 चिकित्सा विज्ञान, 8 निदान, intracellular प्रसव 90-10) गतिविधि और तह का प्रदर्शन किया है. क्योंकि उनके मॉड्यूलर संश्लेषण, मिश्रित peptoid libr15-19 मेष आसानी से हो सकता है और संश्लेषित कर सकते हैं गतिविधियों या गुणों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए जांच की . विशेष रूप से, nanosheets दो आयामी प्रदर्शन scaffolds, झिल्ली mimetics, जैविक सेंसर, प्रोटीन mimetics और उपकरण निर्माण के लिए एक संभावित मंच के रूप में सेवा करते हैं. व्यावहारिक अटूट अलग संभव दृश्यों के साथ, peptoid अनुसंधान के दायरे में तेजी से विस्तार हो रहा है.
ठोस चरण polypeptoids के submonomer संश्लेषण में चर
20 monomers के एक अविश्वसनीय रूप से बड़े और विविध वर्णमाला से चयन करने की क्षमता के कारण, submonomer विधि ऐसे मामलों में जहां हर कदम के युग्मन कार्यकुशलता बढ़ाने के समग्र उत्पाद उपज में सुधार होगा के लिए सामयिक संशोधन की जरूरत है. असुरक्षित heterocyclic पक्ष श्रृंखला के निगमन chloroacetic के बजाय bromoacetic 21 एसिड एसिड के उपयोग की आवश्यकता है. विस्तारित विस्थापन बार और उच्चamine सांद्रता आमतौर पर के बारे में 20 लंबे peptoid दृश्यों या कम nucleophilic amines के लिए couplings के बाद कार्यरत हैं. 35 से प्रतिक्रिया पोत ताप डिग्री सेल्सियस, एक प्रतिक्रिया पानी तख्ताबंदीवाला पोत का उपयोग करके की प्रतिक्रिया ड्राइव करने में मदद करता है. Isopropylamine जैसे अत्यधिक अस्थिर amines के लिए, देखभाल करने के लिए वाष्पीकरण से बचने लिया जाना चाहिए.
टी butyl बीटा alanine एचसीएल के रूप में एक एचसीएल नमक के रूप में, एमाइंस, विस्थापन प्रतिक्रिया में पेश किया जा रहा से पहले मुक्त आधारित की जरूरत है. यह भंग या डीसीएम (~ 5g amine/25 एमएल डीसीएम) में निलंबित amine, और एक जुदा कीप में एक जलीय सोडियम हीड्राकसीड के equimolar समाधान के साथ निष्क्रिय द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. डीसीएम परत एकत्र की है और जलीय परत अतिरिक्त डीसीएम से धोया जाता है. संयुक्त डीसीएम परतों सोडियम सल्फेट पर सूख रहे हैं और एक पूर्व तौला दौर नीचे फ्लास्क में फ़िल्टर्ड. रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक निकालें एक तेल की उपज और उत्पाद वजन रिकॉर्ड.
ड्यूरिनछ दरार कदम, TFA दरार कॉकटेल और दरार के समय इस्तेमाल किया समूहों की रक्षा की संख्या और विविधता पर निर्भर है. दरार कॉकटेल के लिए दिशा - निर्देश पारंपरिक पेप्टाइड deprotection 1 चोली के लिए इसी तरह की हैं. आम तौर पर, 10 मिनट incubations दृश्यों के लिए कुछ अत्यधिक एसिड अस्थिर रक्षा समूहों (जैसे बीओसी, trityl) के साथ समूहों या दृश्यों की रक्षा के बिना आवश्यक हैं. प्रत्येक श्रृंखला का पूरा deprotection सुनिश्चित करने के दो घंटे incubations अधिक मुश्किल रक्षा (जैसे टी butyl एस्टर, मीटर, PBF) समूह या कई रक्षा समूहों के साथ दृश्यों के साथ दृश्यों के लिए सिफारिश कर रहे हैं. क्रूड peptoid उत्पादों को आम तौर पर acetonitrile में भंग होगा: पानी (v / v) 01:01, लेकिन उच्च acetonitrile अनुपात एक उच्च समग्र hydrophobicity के साथ पक्ष श्रृंखला के साथ आम हैं.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए बहुमूल्य सहायता के लिए Byoung - चुल ली, फिलिप चोई और शमूएल हो धन्यवाद देना चाहूंगा. आण्विक फाउंड्री में इस काम से बाहर किया गया था लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला, जो मूल ऊर्जा विज्ञान के विज्ञान कार्यालय, के कार्यालय द्वारा समर्थित है, अमेरिकी ऊर्जा विभाग के अनुबंध के तहत नहीं डे-AC02 - 05CH11231 और सुरक्षा खतरा कटौती अनुबंध नहीं के तहत एजेंसी: IACRO B0845281.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylformamide | EMD Millipore | EM-DX1726P-1 | 99+% |
| N-methylpyrrolidinone | VWR | BDH1141-4LP | 99% |
| Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
| 4-Methylpiperidine | Sigma-Aldrich | M73206 | 96% |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International | 001100 | 99.5% |
| Dichloromethane | EMD Millipore | EMD-DX0835 | ACS grade |
| Acetonitrile | EMD Millipore | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | 99% |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
| 1,2-Dichlor–thane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
| Phenethylamine | Sigma-Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
| Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
| t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
| Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
| Disposable 3 way luer adapter | Cole-Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Luer Lock ring | Cole-Parmer | 45503-19 | 1/4" fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Fittings Luer | Cole-Parmer | 45500-20 | 1/4" fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Disposable PP pipets | VWR international | 16001-194 | For TFA transfers |
| Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
| 1 dram glass vial | VWR international | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
| 20 mL scintillation vial | VWR international | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
| Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
| Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
| Cover slip | VWR international | 48366-067 | For fluorescence imaging |
| 4” Silicon wafer | Ted Pella, Inc. | 16007 | Pre-dice in 5x7 mm chips |
| 0.45 filter | VWR international | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
| Agarose | BD Biosciences | 212272 | For fluorescence imaging |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma-Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
| Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
| Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |
References
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