Summary
Denna video visar tre typer av morfometriska analyser av näthinnan, vilka innefattar mätning av inre kärnskiktet tjocklek, kvantifiering av antalet retinala ganglieceller (RGC) och mätning av storleken på RGC. Tekniken kan erbjuda ett enkelt men vetenskapligt plattform för morfometriska analyser.
Abstract
Morfometriska analyser av näthinnan sektioner har använts i granskningen retinala sjukdomar. För exempel, var neuronala celler signifikant förloras i näthinneganglieceller skikt (RGCL) i råttmodeller med N-metyl-D-aspartat (NMDA)-inducerad excitotoxicitet 1, retinal ischemi-reperfusionsskada 2 och glaukom 3. Minskning av INL och inre plexiformskiktet (IPL) tjocklekar var omvända med citikolin behandling i råtta ögon utsätts för kaininsyra-medierad glutamatexcitotoxicitet 4. Ändring av RGC densitet och storlekar soma observerades med olika läkemedelsbehandlingar i ögonen med förhöjt intraokulärt tryck 3,5,6. Därför kan ha objektiva metoder för att analysera de retinala morphometries vara av stor betydelse vid utvärdering av retinala sjukdomar och effektiviteten av terapeutiska strategier.
Näthinnans struktur är flera lager och flera olika typer av nervceller EXIst i näthinnan. De morfometriska parametrar näthinnan såsom cellantal, cellstorlek och tjockleken hos olika lager är mer komplex än den cellkultursystem. Tidigt kan dessa parametrar detekteras med annan kommersiell programvara för bildbehandling. Värdena är normalt relativt värde, och ändra det exakta värdet kan behöva ytterligare exakt beräkning. Dessutom kan spåra den cellstorlek och morfologi inte noggrann och känslig nog för statistisk analys, särskilt i kronisk glaukom modellen. De mätningar som används i detta protokoll gav en mer exakt och enkelt sätt. Och den absoluta längden av linjen och storleken av cellen kan rapporteras direkt och lätt att kopieras till andra filer. Exempelvis härledas vi marginalen på den inre och yttre mest kärnor i INL och bildade en linje sedan med användning av mjukvara för att dra en 90 graders vinkel för att mäta tjockleken. Medan utan hjälp av programvaran, linjen kanske sneda och föränderliga av retinal tjocklek kaninte vara repeterbar bland individuella observatörer. Dessutom kan antalet och densiteten av RGC också kvantifieras. Detta protokoll minskar framgångsrikt variationen kvantifiering funktioner i näthinnan, ökar känsligheten att upptäcka minimala förändringar.
Denna video kommer att visa tre typer av morfometriska analyser av retinala sektionerna. De inkluderar mätning av INL tjocklek, att kvantifiera antalet RGC och mäta storleken på RGC i absolut värde. Dessa tre analyser utförs med Stereo Investigator (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). Tekniken kan erbjuda ett enkelt men vetenskapligt plattform för morfometriska analyser.
Protocol
1. Verktyg
Mikroskop, Nikon
Stereo Investigator, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.
2. Beredning
- Innan du arbetar på någon morfometrisk analys, är varje näthinna prov snittades vid 4 mikron tjocklek och genomgår H & E färgning.
- Näthinnan sektionen är uppdelad i 4 regioner - övre perifera regionen, den övre centrala regionen, den undre perifera regionen och den nedre centrala området.
- När du har definierat regionerna är en bild av varje region förvärvades 10x40 förstoringar under ljusa strålen mikroskop Nikon.
- Nu är vi redo att analysera morfometri av näthinnan.
3. Mätning INL tjocklek
- Fyra mätningar av INL tjocklek i varje region mättes. Fyra linjer dras vinkelrätt från konturen baslinjen till den yttre gränsen för INL.
- Öppna mjukvaran heter Stereo Investigator och välj 40x objektivet från Main Toolbar.
- Välj "Image Open" under fliken "File". Välj en bild av en önskad retinal region som du vill analysera.
- Välj typ av konturlinjen från rullgardinsmenyn rutan Main Toolbar och tryck på "Auto Move"-knappen.
- Högerklicka i spåra fönstret och välj "klick Tracing".
- Rita konturlinjen längs den inre gränsen för INL.
- När ritningen är klar, högerklicka på spåra fönstret och välj "End öppen kontur".
- Välj en markör vid markören verktygsfältet och lägga till markörer vid knutpunkter.
- Efter att ha lagt alla markörer, avmarkera markören längst Marker Toolbar.
- Placera en markör i centrum av en av markörerna.
- Välj "QuickMät Angle "under fliken" Verktyg ".
- Högerklicka i spåra fönstret och avmarkera "Continuous" alternativet.
- Mäta en vinkel genom att först välja vid centrum av en markör, som ligger intill markören väljs för en ände av linjesegmentet.
- Sedan flytta musen till mitten av den berörda markören och klicka igen.
- Förlänga linjen gummibandet till den yttre gränsen för INL.
- Justera vinkeln tills 90 ° uppnås.
- Vänsterklicka vid den önskade positionen. En dialogruta som visar en vinkelmätning dyker upp direkt efter klicket.
- Tryck på"Enter" medan du håller musen stilla.
- Vänster klicka på spåra fönstret så att en linje dras från ena änden till den nya valda slutet.
- Högerklicka i spåra fönstret och välj "End öppen kontur".
- Dra de andra linjerna vid olika positioner på exakt samma sätt som beskrivits tidigare.
- När du har ritat alla linjer, välj redigeringsläge och byta namn på de 4 linjesegmenten därefter.
- Fyra mätningar kan erhållas genom att trycka på "Kontur Measurement"-knappen.
- Välj dessa 4 mätningar och klistra in dem till ett kalkylblad genom att klicka på "Kopiera till Urklipp".
- Välj "Spara som" under fliken "File". De spåra data kan sparas som en datafil.
- Välj "Image Open" under fliken "File". Välj en bild av en önskad retinal region som du vill analysera.
- Välj typ av konturlinjen från rullgardinsmenyn rutan Main Toolbar.
- Rita en kontur linje längs gränsen till nervfiberskiktet (NFL).
- Avsluta spårning med alternativet "End öppen kontur".
- Vid vardera änden, tillsätt en markör vid spetsen av ledningen och en annan vid den position nära spetsen.
- Avmarkera markören längst markören verktygsfältet.
- Placera en markör i mitten av markörerna i spetsen.
- Välj "Quick Mät Angle" under fliken "Verktyg".
- Högerklicka i spåra fönstret och avmarkera "Continuous" alternativet.
- Justera linjerna gummiband och mäta en vinkel av 90 °.
- Tryck på "Enter" efter att en dialogruta dök upp.
- Vänsterklicka tHan spåra fönstret så att en ny linje kan vinkelrätt ut från spetsen.
- Dra en annan ny rad i exakt samma sätt vid en annan ände.
- Två gränser skapas inuti vilken antalet RGC räknas.
- Välj en gräns som ett undantag linje som cellen berör inte räknas.
- Välj en typ av markör och bifoga en till varje levande cell.
- Välj en annan typ av markör för de döda cellerna.
- Antalet av varje typ av placerade markörer kommer att visas bredvid markören ikonen enlighet med markören verktygsfältet.
- Välj redigeringsläget och plocka upp konturen baslinjen. Högerklicka i spåra fönstret och byta namn på linjen.
- Längden på konturen baslinjen kan erhållas genom att trycka på "Kontur Measurement"-knappen.
- Antalet av de celler kan sedan uttryckas per mm längd.
- Välj "Spara som" under fliken "File". Denspårning och brytpunkt kan sparas som en datafil.
5. Mätning av cellstorleken hos en cell RGC
- Välj "Image Open" under fliken "File". Välj en bild av en önskad retinal region som du vill analysera.
- Zooma in en levande cell och välja den typ av konturlinjen från rullgardinsmenyn rutan Main Toolbar.
- Dra en konturlinje längs omkretsen av cellen.
- Vid ungefär slutet, högerklicka på spårning fönstret och välj "End Close kontur".
- Området i cellen visas under posten för arealen i det Contour Measurement dialogrutan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Hur att få en mer exakt tjockleksmätning?
Du kan förstora bilden genom att klicka på "Zooma in" knappen och vänsterklicka i spåra fönstret. Den INL gränsen kan ses tydligt. Om spetsen av linjen är inte den yttre kanten av INL, kan vi justera linjen under redigeringsläget. Efter att ha plockat den berörda linjen, högerklicka på spårning fönstret och välj "Infoga Point i Selected Contour". En punkt kan läggas till vid den yttre gränsen, medan punkt läggas till bör vara längs samma linje. Sedan måste du ta bort den ursprungliga punkten och en linje med en mer exakt längd kan erhållas.
2. Hur man bibehåller 90 ° av gummiband linjen?
Efter en dialogruta som visar examen dök upp, måste du hålla musen stilla samtidigt som du trycker på "Enter". Sedan lämnade på spåra fönstret så att en ny linje kan dras.
3. Hur levande celler och döda calnar ut?
De celler i en ungefär rund form med cytoplasman och kärnan tydligt observeras betraktas som levande RGC. De jämförelsevis små och kondenserad celler betraktas som döda celler.
4. Dessa näthinnan prover genomgått H & E färgning i det nuvarande protokollet. Är det möjligt att mäta näthinnan provet med fluorescerande färgning?
Ja. Även om den nuvarande protokoll är på H & E färgning retinala sektioner, den retinala provet med fluorescerande färgning kan även mäta på samma sätt. Till exempel, såsom visas i figur 1 med användning av DAPI-färgning, kommer alla kärnorna vara färgade och visualiseras blå färg enligt en 405 nm-filter. Kärnorna i den retinala ganglionceller skikt (RGCL) kan inre kärnskiktet (INL) och yttre kärnskiktet (ONL) ses. Därefter tjockleken av olika skikt kan detekteras på ett liknande sätt visat i denna video.
Figur 1.
Om storleken på olika färgade fluorescerande signaler, har vår grupp har publicerat en artikel om om storleken på nervceller i RGCL i en rått glaukom modell (Luo et al, 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet med ögat forskning inom detta laboratorium stöds av American Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund och HKU fond för småskaliga projekt (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
