Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Summary

Omfanget af butikken betjente Ca

Abstract

Store drives ^{Ca2 +} indgang (SOCE), tidligere betegnet kapacitive ^{Ca2 +} indgang, er et stramt reguleret mekanisme til indstrømning af ekstracellulært ^{Ca2 +} i celler for at genopfylde depleteret endoplasmatiske reticulum (ER) eller sarcoplasmatisk reticulum (SR) Ca ^{2 +} lagrer ^1,2. Idet ^{Ca2 +} er et ubikvitært anden messenger, er det ikke overraskende at se, at SOCE spiller vigtige roller i en række af cellulære processer, herunder proliferation, apoptose, gentranskription og motilitet. På grund af dets udbredte forekomst i næsten alle celletyper, herunder epitelceller og skeletmuskulatur, har denne vej modtaget stor interesse ^3,4. Imidlertid er heterogenitet SOCE egenskaber i forskellige celletyper og den fysiologiske funktion endnu ikke klart ^5-7.

De funktionelle kanal egenskaber SOCE kan afsløres ved patch-clamp-forsøg, mens en stor mængde viden om this pathway er opnået ved fluorescens-baserede ^{intracellulær} Ca2 ⁺ målinger på grund af dens bekvemmelighed og gennemførligheden til high-throughput screening. Formålet med denne rapport er at opsummere nogle fluorescens-baserede metoder til at måle aktiveringen af SOCE i monolag celler, suspenderede celler og muskelfibre ^5,8-10. Den mest almindeligt anvendte af disse fluorescens metoder til direkte at overvåge dynamikken af intracellulær ^{Ca2 + under} anvendelse af forholdet mellem F _{340 nm} og F _{380 nm} (510 nm for emission bølgelængde) af det ratiometrisk ^{Ca2 +} indikator Fura-2. At isolere aktiviteten af ensrettede SOCE fra intracellulære ^{Ca2 +-frigivelse og} Ca2 ^{+-ekstrudering,} er en ^{Mn2 +-quenching} assayet anvendes ofte. ^{Mn2 +} vides at være i stand til at trænge ind i celler via SOCE mens det er uigennemtrængeligt for overflademembranen ekstruderingsprocesser eller ER optagelse af Ca ^{2 +} pumper på grund af sin meget høje affinitet vidh Fura-2. Som et resultat heraf repræsenterer quenching af Fura-2 fluorescens induceret ved optagelse af ekstracellulær ^{Mn2 +} i cellerne en måling af aktiviteten af SOCE ^9. Ratiometrisk måling og Mn ⁺² afkølende assays kan udføres på en kuvette-baseret spektrofluorometer i en cellepopulation tilstand eller i et mikroskop-baseret system til at visualisere enkelte celler. Den fordel, encellede målinger er, at individuelle celler udsat for gen manipulationer kan vælges ved hjælp af GFP eller RFP reportere, så studier i genetisk modificerede eller muterede celler. De spatiotemporal karakteristika SOCE i strukturelt specialiserede skeletmuskel kan opnås i isolerede muskelfibre ved samtidig overvågning af fluorescensen af to lave affinitet ^{Ca2 +} indikatorer rettet mod specifikke rum i musklen fibre, såsom Fluo-5N i SR og Rhod- 5N i den tværgående tubuli ^9,11,12.

Protocol

1. Intracellulær ^{Ca2 +} måling for individuelle celler

1. Kyse-150, en human esophageal pladecellecarcinom (ECSS) cellelinie dyrkes i 5% _{CO2-atmosfære} ved 37 ° C i blandet RPMI 1640/Ham 's F-12 medium (1:1) indeholdende 5% føtalt bovint serum.
2. Kyse-150-celler transficeret med plasmiderne enten indeholder shRNA specifikt mod Orai1 eller et kodet sekvens. Plasmiderne også et gen, der koder rødt fluorescerende protein (RFP) som en reporter, som drives af en separat promotor.
3. Cellerne dyrkes i glas-bund retter (nr. 1,5 dækglas, Mattek, MA) i 48 timer.
4. Fjernelse af mediet og skylles cellerne med en balanceret saltopløsning (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCI, 2 mM CaCI _2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
5. Tilsæt 1 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 acetoxymethylester (Molecular Probes) i skålen og pak hele skålen med folie til protect mod lys.
6. Inkubér cellerne i 40 minutter ved 37 ° C og derefter lade dem i yderligere 15 min periode ved stuetemperatur for at tillade esterhydrolyse afsluttet. Vask cellerne med BSS to gange.
7. Montere parabol på scenen af ​​Nikon TE200 omvendt mikroskop, som er forbundet til PTI spektrofluorometer, med excitationsbølgelængder på 350 og 390 nm og emission ved 510 nm. De nøjagtige excitationsbølgelængder, der skal anvendes, kan variere lidt alt efter optik for hvert enkelt system. De to bølgelængder med bedste forhold dynamisk bestemmes ved ekscitationsspektret scanning af Fura-2-salt i opløsninger indeholdende ^{Ca2 +} i området fra 0 til 39,8 uM (eller højere koncentration, ved hvilken Fura-2-fluorescens er mættet).
8. Etablere et tyngdekraft perfusionssystem med 4 forskellige opløsninger i BSS: Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 uM), ^{Ca2 +-2-APB} (en SOCE inhibitor, 75 uM). Computer-kontrollerede automatiseret perfusipå systemer kan også anvendes.
9. Marker de celler, der udtrykker RFP i visualisering tilstand.
10. Placere åbningen spidsen af ​​perfusionssystemet til 10x forstørrelse indtil spidsen er lige over området af interesse i en 45 graders vinkel.
11. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F _{350 nm} og F _{390 nm.} Forholdet (F _{350 nm} / F _{390 nm)} er vist i det tredje vindue. Ændre perfusionsopløsninger i følgende rækkefølge: ^{Ca2 +,} EGTA; ^{Ca2 +,} EGTA-TG, ^{Ca2 +, Ca2 +-2-APB.}

Den ovennævnte protokol kan modificeres til måling af intracellulær ^{Ca2 +} i cellesuspension system.

12. Kultur Kyse-150 celler i en T25 kolbe med den samme kultur betingelser som ovenfor.
13. Når cellerne når 90% konfluens, fjernes mediet og skylles cellerne med en BSS opløsning.
14. Tilsættes 2,5 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 AM og inkuberescellerne i 40 minutter ved 37 ° C efterfulgt af deesterificering.
15. Fjerne BSS, tilsættes 2,5 ml trypsin i kolben og inkuber ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes. Derefter tilsættes 2,5 ml dyrkningsmedium for at standse trypsinisering og høste cellerne ved centrifugering ved 800 rpm i 5 min.
16. Vask cellerne med dyrkningsmedium en gang ved centrifugering og genopslæmmes cellernes pellet i BSS opløsning (uden tilsætning af 2 _mM CaCl2, som indeholder um ^{Ca2 +)} og tælle celler nummeret med en hematometer.
17. Tilsættes ~ 10 ⁶ celler i en kvartskuvette (10 mm, Starna celler) og fylde volumenet op til 2 ml med BSS.
18. Anbring kuvette (omrøring med en magnetisk stang) i spektrofluorometer.
19. Samtidigt registrerer fluorescenssignaler F _{340 nm} og F _{380 nm} med emissionsbølgelængde på 510 nm. Driften protokol er: BSS, tilsætning af 0,5 pi EGTA (0,25 M stamopløsning), tilsætning af 1 pi thapsigargin(TG, 10 mM stamopløsning), tilsætning af 4 gl ^{Ca2 +} (1 M stamopløsning).

2. Mn quenching assayet i dyrkede celler

1. Udføre excitationsbølgelængden scanning af Fura-2 i opløsninger indeholdende forskellige Ca ^{2 +-koncentration} i området fra 0 til 39,8 uM at bestemme Ca uafhængig af koncentrationen bølgelængde som det isosbestiske punkt. Sædvanligvis det isosbestiske punkt er ved eller omkring 360 nm.
2. Kyse-150-celler dyrkes i glas-bund skåle og fyldt med Fura-2 AM.
3. Opsætte perfusionssystem med 5 forskellige BSS opløsninger: ^{Ca2 +} (2 mM), EGTA / TG (0,5 mM og 5 uM, henholdsvis), ^{Mn2 +} (0,5 mM, uden tilsætning af EGTA eller Ca ^{2 +,} som indeholder fri ^{Ca2 +} i um), ^{Mn2 +} / 2-APB (75 uM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Montere parabol på scenen af ​​mikroskopet og vælg "Excitation Ratio" mode med excitationsbølgelængder på 360 nm og 390 nm og emission ved 510nm.
5. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F _{360 nm} og F _{390 nm} med Ratio (F _{360 nm} / F _{390 nm),} der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: ^{Ca2 +} i 1 minut for at stabilisere fluorescens, ^{Mn2 +} i 30 sek, EGTA / TG i 10 minutter, ^{Mn2 +} i 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) i 1 min til opnåelse af baggrunden aflæsning. ^{Mn2 +} / 2-APB-opløsning kan anvendes i stedet for ^{Mn2 +} for at undersøge afskaffet fluorescensundertrykkelse, hvilket indikerer, at ^{Mn2 +} indgang gennem SOCE pathway.

3. Mn quenching assayet i muskelceller

1. C2C12, en muse myogene cellelinie, der dyrkes på glas-bund retter i 5% _{CO2-atmosfære} ved 37 ° C i DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 10% hesteserum.
2. Efter at cellerne når konfluens, er dyrkningsmediet skiftet til differentiering medium (fjern føtalt bovint serum og reduktione hesteserum til 2,5%). De C2C12 myoblaster vil differentiere til myotuber efter 4 dage.
3. Indlæse C2C12 myorør med en endelig koncentration på 5 uM Fura-2 AM som beskrevet i 1,4-1,6.
4. Tilføje en slutkoncentration på 20 uM N-benzyl-p-toluen-sulfonamid (BTS) til at inhibere muskelsammentrækninger og bevægelsen artefakter forårsaget af dem og tillade 15 min før initiering af forsøget.
5. Montere parabol på scenen af mikroskopet er forbundet til PTI enheden og indlæse følgende BSS løsninger i perfusionen systemet: 2 Ca ^{2 +} (2 mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0,5 mM), Mn ^{2 +} / TG (0,5 mM, 20 pM, henholdsvis).
6. Oprettet perfusionssystem som beskrevet ovenfor.
7. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F _{360 nm} og F _{390 nm} med Ratio (F _{360 nm} / F _{390 nm),} der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: 2 ^{Ca2 +} i 1 min, 0 ^{Ca2 +} i 1 min til flUSH væk ^{Ca2 +, Mn2 +} i 0,5 min, ^{Mn2 +} / TG i 10 minutter, og ^{Mn2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfibre

1. Forbered følgende løsninger.
   Isotonisk Tyrode-puffer: 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm
   Dyrkningsmedium: DMEM med 2% hesteserum og 1% penicillin og streptomycin
   Vaskeopløsning # 1: 109,6 mM K-glutamat, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM creatinphosphat (CP), 20 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyrepuffer syre (BES)-KOH, pH 7,0
   Vaskeopløsning # 2: 140 mM K-glutamat, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   Flåning opløsning: 140 mM K-glutamat, 6,5 _mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   TT-loadingOpløsningen: 90,6 mM K-glutamat, 18 mM Na-glutamat, 0,55 mM _CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 _mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml kreatinkinase (CK), 20 mM BES-KOH, 5 uM carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0
   SR belastning opløsning: 107,8 mM K-glutamat, 0,98 mM _CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 _mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0, PCA 6,6
   SR nedbrydende opløsning: 100 mM K-glutamat, 40 mM Na-glutamat, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (o-aminophenoxy) ethan-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (BAPTA ), 0,35 mM _MgCl2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 uM thapsigargin (TG) tilsættes før eksperimenterne.
2. At dissekere den extensor digitorum longus (EDL) muskel, først fastlægge de mus og arrangere benet på lateral position, så fjern skindet fra anklen området op til knæet, skæresde overfladiske muskel lag af væv for at blotlægge EDL, og afskære både de øvre og nedre sener at frigøre den intakte EDL muskler, er det vigtigt at holde sener så længe som muligt. EDL overføres til en Tyrode-opløsning indeholdende 0 ^{Ca2 +} og 0,1 mM EGTA for at undgå kontraktioner.
3. Under et stereomikroskop, skal du bruge to pincet til at holde lavere indsættelse sener og dele EDL muskel i to bundter. Gentag processen for at opnå 4 og derefter 8 bundter. Det er kritisk, sener forbliver for hver af de 8 bundter ved slutningen af ​​processen. Hvis de bliver tabt fra nogle bundter, kassere dem.
4. Under et stereomikroskop, hver EDL bundt strimmel griped på både sener og omhyggeligt strakte sig indtil 3 ~ 4 adskilte enkelte muskelfibre står tilbage intakt med sener på begge sider.
5. Put 1 dråbe af Ca ^{2 +} Tyrode buffer i midten af glasset bund fad, fastsætter EDL strimler lige på fadet, hurtigt at fjerne så meget som muligt afløsning, så tape ned på begge sener med vandafvisende tape, og sørg for båndet er stramt. Vaskes fiberen først med 0 ^{Ca2 +-opløsning} og derefter med en 2,5 ^mM Ca2 ⁺ opløsningen 2 gange. Hvis fiberen hyper-kontrakter, og skaden er bemærket, kasseres fiber.
6. Hvis det er nødvendigt, kan fiberen dyrkes i op til 96 timer, hvilket giver genetiske manipulationer. Vask fiberen 3 gange med komplet dyrkningsmedium, og der tilsættes 2 ml medium i skålen, sted i _5% CO2 og 37 ° C inkubator. Før hvert forsøg, undersøger muskelfibre, og smid dem uden klare striation eller med tegn på forurening, eller med tegn på skader såsom kontraktur af sarcolemmal membranen. Gode ​​fibre reagere KCI, elektrisk stimulering, og koffein stimulering.
7. Enkelte muskelfibre vaskes 3 gange med vaskeopløsningen # 1 og badet i intracellulær-lignende afhudning opløsning med 500 pM Rhod-5N og 0,5 ^mM Ca2 ⁺ i 5 minutter.
<li> Ved hjælp af en Wolfram nål fastgjort til en stift holder, mekanisk huden fiber under et stereomikroskop, så tværgående tubuli (TT) til automatisk reseal og at fange den Rhod-5N konjugeret med Ca ^{2 +} i TT, vaske de flåede fibrene to gange med vask løsning # 2. Den mekaniske flåningen proces er optimal, når mindre end 25% af cellens bredde fjernes under flåningen processen.
8. At indlæse SR er isolerede fibre inkuberes med flåning opløsning indeholdende 20 pM Fluo-5N AM i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af omfattende vask med vaskeopløsningen # 2, og inkuberes i yderligere 30 minutter for at tillade fuldstændig de-esterificering af farvestoffet.
9. Efter 30 minutter er isolerede fibre visualiseret under 60X formål konfokalt mikroskop. Fluorescensbilleder erhverves ved bølgelængder i de tilsvarende farvestoffer (excitation ved 543 nm og emission længere end 570 nm for Rhod-5N, excitation ved 488 nm og emission ved 530-560 nm for Fluo-5N). Regions af interesse (ROIs) er valgt for hvert farvestof belastede områder.
10. Den eksperimentelle protokol er som følger: TT-loading opløsning til 120 s, SR-loading opløsning til 120 s, SR-depletion opløsning 400-750 s til nedbryder SR ^{Ca2 +-lagre.} Under denne proces, er ændringer i Rhod-5N intensitet (TT ^{Ca2 +)} og Fluo-5N intensitet (SR ^{Ca2 +)} registreres, hvilket skaber et tidsforløb bestemmelse af relative fluorescens ændringer i TT og SR. Middelværdierne for fluorescensintensitet fra multiple fibre analyseres yderligere. Den maksimale belastning intensitet ved udgangen af ​​TT / SR-lastning normaliseres til 100%.

5. Repræsentative resultater

Vi undersøgte SOCE aktivitet Kyse-150-celler under anvendelse intracellulær ^{Ca2 +-måling} (figur 2).. Anvendelse RFP som reporter, kan man vælge de individuelle celler transficeret med plasmid indeholdende specifikke shRNA mod orai1, et gen kodende for SOCE channel. Sammenlignet med celler transficeret med plasmider indeholdende scramble shRNA (sort spor) er vælte af Orai1 protein resulterer i nedsat SOCE aktivitet (rød spor).

SOCE i Kyse-150-celler blev også bekræftet med ^{Mn2 +} quenching assayet (figur 3).. Excitationsbølgelængden 360 nm rapporterer det isosbestiske punkt af Fura-2, hvor fluorescens er uafhængig af ^{Ca2 +-koncentration.} Efter TG fuldstændigt udtømt ER ^{Ca2 +} butikker, perfusionen af ^{Mn2 +} resulterede i en signifikant fluorescens fald. Den samlede SOCE aktivitet kan måles ved et fald på Fura-2 fluorescensintensitet med en stejlere hældning indikerer en mere aktiv SOCE, mens en fladere hældning betydning en mindre aktiv SOCE. Hældningen af ​​fluorescens fald i 2-APB behandlede celler viste sig at være meget fladere, hvilket indikerede, at SOCE aktivitet blev blokeret af denne forbindelse. Mn^{2 +} quenching satser blev bestemt ud fra registreringen af de første 10 sekunder, hvor quenching var stadig i lineære område uden mætning.

En lignende ^{Mn2 +} quenching assayet blev udført i musklen (figur 4).. I dette tilfælde ^{Mn2 +} blev anvendt sammen med TG. Mens TG blev nedbryder ^SR Ca2 ⁺ butikkerne, fluorescensstandsning hældningen gradvist ændret sig, indtil det nåede sin maksimale hastighed. Den sigmoidal kurve angiver det graduerede aktivering af SOCE under disse eksperimentelle betingelser.

Sund og intakt enkelte muskelfibre i kultur viste klar og ensartet striation, ingen tegn på forureninger, og ingen tegn på nedgang-induceret skade. Disse fibre var i stand til at trække sig som reaktion på elektrisk stimulation eller depolariserende løsninger. Under konfokal billeddannelse viste flået fiber indfangning af Rhod-5N farvestof i TT rum, karakteristiske pattedyr dublet mønster (visualized i den røde kanal). Efter læsning af SR med Fluo-5N AM, var den typiske afbrudt SR mønster synligt (i grøn kanal). Efter perfusion af hud fiber med TT / SR lastning opløsning forøget fluorescensintensitet af både Rhod-5N og Fluo-5N, ved perfusion med SR depletion opløsning begyndte niveauer af fluorescens i SR kammeret og TT rum at falde, hvilket indikerer tæt kobling mellem SR ^{Ca2 +-lagre} opbrug og SOCE aktivering, henholdsvis (figur 5)..

Figur 1. Aktivering af ^{store-Ca2 +-optagelse} (SOCE). Orai1 er en kanal poredannende enhed placeret på plasmamembranen (PM) og STIM1 en ^{Ca2 +-sensor,} der er placeret på det endoplasmatiske eller sarcoplasmatisk reticulum (ER / SR) membraner. Når ER / SR ^{Ca2 +-lagre} reduceres enten på grund af blokering af ER / SR ^{Ca2 +-pumpe} (SERCA) eller ^{Ca2 +-frigivelse} via IP _3-receptor eller ryanodine receptor, STIM1 aktiveret. Aktiverede STIM1 molekyler danner patches og inducere aggregering af Orai1, hvilket yderligere fører aktivering af SOCE.

Figur 2. Måling af intracellulær ^{Ca2 +} i Kyse-150 celler. Udveksling af ekstracellulær opløsning fra 0 ^{Ca2 +} (0,5 mM EGTA) og 2 mM ^{Ca2 +} inducerede ikke nogen ændring i intracellulær ^{Ca2 +.} 5 uM TG i 0 Ca ^{2 +} badopløsningen induceret passiv ER Ca ^{2 +} frigivelse. Efter ER ^{Ca2 +-lagre} blev udtømt (> 10 min), tilsætning af ekstracellulær ^{Ca2 +} (2 mM) aktiveres en vedvarende intracellulær ^{Ca2 +} lodret gennem SOCE, som kan blokeres af SOCE inhibitorer, fx SKF-96.365 og 2 - APB (data ikke vist). Celler transficeret med plasmider indeholdende shRNA specifikt modorai1 (rød) viste signifikant reduceret SOCE end celler transficeret med scramblesekvens (sort).

Figur 3. ^{Mn2 +} quenching assayet SOCE i Kyse-150 celler. Quenching af Fura-2-fluorescens ved ^{Mn2 +} (0,5 mM) blev målt ved ^{Ca2 +-uafhængig} excitationsbølgelængde på Fura-2 (360 nm). Cellerne blev behandlet med 5 pM TG i 10 minutter til fuldstændig nedbryder ER Ca ^{2 +} butikker. Henfald Hældningen af Fura-2 fluorescens efter ^{Mn2 +} tilsætning (stiplede linier, indenfor de første 10 sek) repræsenterede aktivering af SOCE, der blev udtrykt som procent reduktion i fluorescens pr tidsenhed (den oprindelige værdi som 100%). Den maksimalt bratkølede fluorescenssignal blev etableret ved slutningen af ​​forsøget ved lysering af cellerne med 0,1% Triton X-100 (som 0%). Celler behandlet med 2-APB (75 uM) viste en meget fladerehældning, hvilket tyder SOCE blokeres af denne forbindelse i Kyse-150-celler.

Figur 4. Gradueret aktivering af SOCE i muskelceller afsløret ved ^{Mn2 +} quenching assayet. Aktivering af SOCE kan registreres, medens TG nedbryder SR ^{Ca2 +-lagre.} Samtidig anvendelse af ^{Mn2 +} (0,5 mM) og TG (20 uM) inducerede en gradueret-og S-formet fald i intracellulært Fura-2-fluorescens (cyan stiplet linie for at vise den hurtigste bratkøling point), der var forskellig fra den første ^{Mn2 +} quenching sats (blå streg linje). ^{Mn2 +} quenching hældning var næsten det samme som basisniveauet i celler behandlet 2-APB (75 uM), hvilket antyder, at SOCE blev inhiberet.

Figur 5. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfiber. (A) RhOD-5N-salt blev fyldt i TT og Fluo-5N AM blev fyldt i SR. (B) Efter påføring ^{Ca2 +} depletion opløsning faldt fluorescensen i både TT og SR rum. Tabet af Fluo-5N fluorescens angivet hurtigt frigives SR ^{Ca2 +-indholdet} og tab af Rhod-5N fluorescens foreslået aktivering af SOCE.

Discussion

Skønt de excitationsbølgelængder for ^{Ca2 +-bindende} og ^{Ca2 +-fri} Fura-2 er 340 nm og 380 nm, det bedste forhold dynamikområde Fura-2 for ^{Ca2 +-koncentration} kan forekomme ved andre bølgelængder i en bestemt mikroskopsystem. Sådanne ændringer i bølgelængden er normalt på grund af ændringer i den optiske vej med tilsætning af forskellige optiske komponenter. I denne undersøgelse blev excitationsbølgelængder for Fura-2 bestemmes som 350 nm og 390 nm ved at udføre spektralanalyse af Fura-2-fluorescens.

Den intracellulære ^{Ca2 +-niveauet} i cytosolen resultaterne fra en balance af flere kilder, herunder intracellulære ^{Ca2 +-frigivelse, ekstracellulær} Ca2 ⁺ indgang, samt Ca ^{2 +} udelukkelsesmekanisme på ER og plasmamembranen. At isolere ensrettede SOC-medieret ^{Ca2 +-indstrømning} fra intracellulære ^{Ca2 +-frigivelse og} Ca2 ⁺ Udvindingusion kan ^{Mn2 +} quenching assayet anvendes. ^{Mn2 +} vides at være i stand til at trænge ind i celler via SOCE men er uigennemtrængeligt for overflademembranen ekstrudering eller ER optagelse af ^{Ca2 +} pumper. Derfor fluorescensundertrykkelse repræsenterer en måling af ensrettet ^{Mn2 +} flux i celler, der estimerer graden af aktivering af SOCE. ^{Mn2 +} quenching assayet udføres på det isosbestiske punkt, ved en sådan bølgelængde Fura-2 fluorescensintensitet er uafhængig ^af Ca2 ^{+-koncentration.} Det isosbestiske punkt for hvert system bør bestemmes af spektret scanning. Alternativt kan ^{Mn2 +} quenching registreres af justerede fluorescens ved enhver to bølgelængder på en sådan måde, at den endelige værdi er uafhængig af ^{Ca2 +-koncentration 13.}

For at få den rumlige og tidsmæssige oplysninger om aktivitet SOCE i skelet muskler, vi ansat en dobbelt-farvestof metode, der giver mulighed for samtidig Måleperiodent af SOCE aktivitet og SR ^{Ca2 +-indholdet} i isolerede voksne mammale EDL muskelfibre. Korrelationen mellem ændringer i SR ^{Ca2 +-indholdet} og SOCE aktivitet kan afbildes at angive tærsklen og følsomheden af SOCE aktivering til nedbrydning af SR ^{Ca2 +} opbevaring. TT-loading opløsning optimeret til yderligere indlæse T-tubuli ^med Ca2 ⁺ og til priming af T-tubuli og SR-lastning løsning er designet til at fremme maksimal SR ^{Ca2 +-lastning} og yderligere indlæse T-tubuli med ~ 500 uM ^{Ca2 +.} FCCP er inkluderet i TT / SR-loading opløsning og SR-depleterende opløsning for at fjerne effekter fra mitokondrier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).