Summary

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

Published: March 14, 2012
doi:

Summary

ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.

Abstract

هناك فئتين متميزتين من الصور المكونة للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية الفقاريات: قضبان ومخاريط. قضبان هي قادرة على الكشف عن الفوتونات واحد للضوء في حين المخاريط بشكل مستمر تحت الظروف المتغيرة بسرعة الضوء الساطع. امتصاص الضوء بواسطة قضيب وأصباغ مخروط محددة البصرية في قطاعات الخارجي من المستقبلات الضوئية يتسبب في سلسلة phototransduction أن يؤدي في النهاية إلى إغلاق قنوات النوكليوتيدات بوابات دوري على غشاء البلازما وفرط الاستقطاب الخلية. ويمكن تسجيل هذا التغيير الناجم عن ضوء في غشاء الحاليين والمحتملين بمثابة photoresponse، إما عن طريق الشفط الكهربائي الكلاسيكية 1،2 تقنيات التسجيل أو عن طريق التسجيلات مخطط كهربية الشبكية transretinal (ERG) من شبكية العين معزولة مع سدت عقاقيري مكونات استجابة بعد المشبكي 3-5. الأسلوب الأخير يسمح للأدوية في متناول طويلة الأمد تسجيلات من المستقبلات الضوئية الماوس ومفيد بشكل خاص للحصول على photoresponses مستقر الابأم المخاريط الماوس نادرة وهشة. في حالة المخاريط، يمكن تنفيذ مثل هذه التجارب على حد سواء في الظروف المظلمة مكيفة والإضاءة المكثفة التالية التي التبييض أساسا جميع الصباغ البصرية، لرصد عملية الانتعاش حساسية مخروط خلال التكيف مع الظلام 6،7. في هذا الفيديو، وسوف نعرض كيفية تنفيذ قضيب وM / L-مخروط يحركها التسجيلات transretinal من الظلام تكييفها شبكية العين الماوس. وسيتم استخدام التسجيلات قضيب من شبكية العين من النوع البري (C57BL / 6) الفئران. عن البساطة، وسوف يتم الحصول على تسجيلات مخروط من transducin قضيب المعدلة وراثيا α وحدة فرعية خروج المغلوب (Tα – / -) الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8.

Protocol

1. صنع أقطاب إعداد أقطاب الزجاج. وزنه 120 ملغ أجار ومزجها في الماء المقطر 10 مل (نهائي تركيز أجار 1.2٪). إذابة حل أجار في حمام الماء الساخن. شغل الزجاج الشعيرات الدموية (نستخدم أدوات Presision كلمة TW100-4 الشعيرات الدموية مع الأبعا?…

Discussion

ووصف أسلوب العصا والمخروط يحركها التسجيلات ERG transretinal أعلاه أصبح أداة قوية لتحقيق وظيفة من المستقبلات الضوئية الماوس في كل نوع البرية والحيوانات المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى توصيف سهل من خصائص photoresponse الأساسية، وهذا أسلوب بسيط ويوفر استقرار كبير خلال استجابة طويلة ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بدعم من جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى، والمعاهد الوطنية للصحة منح EY19312 EY19543 (VJK)، وكذلك منح المطلقة من البحوث للوقاية من العمى وEY02687 (قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DL-AP-4   TOCRIS bioscience 0101  
All other reagents   Sigma-Aldrich    
Glass capillaries   World Precision Instruments TW100-4 For making electrodes
Filter paper HARG Millipore HABG01300  
Photometer   UDT Instruments S350 For light calibration
Radiometric silicon sensor   UDT Instruments 221 For light calibration
Anti-vibration table   Technical Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 To minimize mechanical noise
Air compressor Panther P 15TC   Werther International P 15TC Connected to anti-vibration table
Stereomicroscope   LEICA MZ9.5 For mouse eye dissection
Infrared image converters   B.E.Meyers ProwlerTM Bound to stereomicroscope
Differential amplifier
DP-311
  Warner Instruments DP-311  
Axon Digidata 1440A Digitizer   Molecular Devices 1440A  
Dual Channel 8-pole Filter   KROHN-HITE Corporation 3382  
Ceramic resistor   TE Connectivity CGS SBCHE618RJ For reheating the perfusion solution
Thermocouple T Physitemp Instruments IT-18  
Temperature monitor   Omega DPi32 Connected to thermocouple
LED 505 nm   TT Electronics/ Optek Technology Digi-key P/N 365-1185-ND To apply test flashes/bleaching light
Cautery pen   Bovie AA25 For marking the dorsal part of the mouse eyeball
pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software   Molecular Devices    

References

  1. Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
  2. Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
  3. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  4. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  5. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  6. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  7. Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
  8. Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
  9. Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
  10. Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
  11. Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
  12. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).

Play Video

Cite This Article
Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses. J. Vis. Exp. (61), e3424, doi:10.3791/3424 (2012).

View Video