Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Abstract

ישנם שני סוגים שונים של התמונה יוצרי photoreceptors ברשתית חוליות: מוטות קונוסים. מוטות מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור בעוד גביעי לפעול ברציפות תחת המשתנה במהירות בתנאי תאורה בהירים. קליטת האור על ידי מוט ו חרוט ספציפיים פיגמנטים ויזואליים של המגזרים החיצוניים של photoreceptors מפעילה מפל phototransduction שבסופו של דבר מוביל סגירת נוקלאוטיד-מגודרת ערוצי מחזורית על קרום פלזמה hyperpolarization התא. שינוי זה האור הנגרמת בקרום הנוכחי ופוטנציאל יכול להיות רשום כ photoresponse, על ידי ^1,2 קלאסית האלקטרודה יניקה הקלטה לטכניקה או הקלטות electroretinogram transretinal (ERG) של הרשתית מבודדים עם חסומים פרמקולוגית רכיבים תגובה postsynaptic ^3-5. השיטה השנייה מאפשרת סמים נגישים לטווח ארוך הקלטות של photoreceptors העכבר הוא שימושי במיוחד עבור קבלת photoresponses יציבים frאום את הקונוסים עכבר נדיר ושברירי. במקרה של קונוסים, ניסויים כאלה יכולים להתבצע גם בתנאי חושך, המותאמים תאורה חזקה הבאה זה עלול להלבין למעשה כל פיגמנט ויזואלי, כדי לפקח על תהליך ההתאוששות של רגישות חרוט במהלך עיבוד כהה ^6,7. בסרטון הזה, אנו נראה כיצד לבצע מוט ו-M / L-חרוט מונחה הקלטות transretinal של הרשתית כהה מותאם העכבר. הקלטות רוד יבוצע באמצעות הרשתית מסוג (C57Bl / 6) עכברים בטבע. לשם הפשטות, הקלטות חרוט יהיה לקבל מהונדסים גנטית מוט transducin α-למקטע בנוקאאוט (Tα ^{- / -)} עכברים אשר חסרים מוט איתות ^8.

Protocol

1. ביצוע אלקטרודות

1. הכן אלקטרודות זכוכית. שוקל 120 מ"ג אגר ומערבבים אותו במים מזוקקים 10 מ"ל (ריכוז אגר האחרון 1.2%). ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו כוס נימים (אנו משתמשים Presision מכשירים וורד TW100-4 נימים עם הממדים הבאים: אורך = 100 מ"מ, OD / ID = 1/0.75 מ"מ, ונפח פנימי = 44 μL) עם פתרון אגר באמצעות מזרק פלסטיק. לחזק אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לכן, עד ~ 200 נימים יכול להיות מלא (את שאר התערובת אגר ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס, שימוש חוזר כמה פעמים).
2. חותכים לחצאים נימים באמצעות סכין יהלום.
3. משרים את אלקטרודות זכוכית וכתוצאה מכך לפתרון האלקטרודה העכבר לפחות 24 שעות 4 ° C. אחסן את האלקטרודות על 4 ° C, ולהשתמש בהם על פני תקופה של 3-4 חודשים.

2. הגדרת ניסוי

1. כהה להתאים עכבר לילה. השתמש בסוג בטבע (למשל, C57Bl / 6) עכברים עבור מוט מונחה הקלטות transretinal ו T אלפא ^{- / -} עכברים מוט חסר איתות ⁸ להקלטות חרוט transretinal.
2. הכן 1 זלוף L פתרון, 100 אלקטרודה פתרון מ"ל ו -20 מ"ל הדגירה פתרון (ראה להלן) ולסנן שוקת פתרון זלוף כמה Millipore 0.45 מיקרומטר או 0.22 מיקרומטר פילטר (לא חובה).
3. לכייל את מקור האור (505 ננומטר LED או נורת הלוגן ממריץ אופטי) באמצעות פוטומטר ממוקם על המטוס של הרשתית. במקרה של מקור אור LED, השתמש מפזר אופטי כדי להשיג אחידות אור.
4. להכין את חדר זלוף לניסוי (קונסטרוקציות קאמרית עשוי להשתנות). הלילה שלנו עשוי פרספקס 3 מ"מ, עם תחתית עשויה מכסה של צלחת פטרי פלסטיק קטנה, ויש לו נפח זלוף פעיל ~ 400 μL (L = 25 מ"מ, W = 8 מ"מ, H ≈ 2 מ"מ). למלא את החלל האלקטרודה התחתון של החדר עם פתרון אלקטרודה המכילה 2 מ"מ L-גלוטמט ו 10 mM BaCl ₂. באמצעות צינורות פלסטיק זכוכית נימי, ליצור חיבור בין הפתרון בחלל אלקטרודה נמוכה יותר (עשוי מחבר צינור פלסטיק מחובר אל תחתית תא) ובעל האלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה, צינורות חיבור, או בעל אלקטרודה (לטהר את הפתרון באמצעות מזרק פלסטיק במידת הצורך).
5. הר תא הקלטת על הבמה של מיקרוסקופ (לא חובה: מיקרוסקופ יכול להיות מותקן על השולחן נגד רעידות ו מוגן בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש מכני אלקטרומגנטי). חבר את מחזיק האלקטרודה נמוך לקוטב headstage החיובי של מגבר ההפרש (למשל וורנר מכשירים DP-311 מגבר). מרכז וליישר את האלקטרודה בתא התחתון לפתוח עם כתם האור גירוי. חבר את קו זלוף אל חדר ההקלטה ולהפוך זלוף על.
6. הבועה זלוף פתרון עם 95% מ _2/5% CO ₂ תוך דוגרים אותו 40 מעלות צלזיוס וואטאה אמבטיה. CO ₂ מתאים את ה-pH של התמיסה ל 7.2. פתרון זורם מהבקבוק אל חדר ההקלטה על ידי כוח הכבידה עובר דרך הנגד קרמיקה מחמם שוב את אותה 36-37 ° C. כדי להפחית את אובדן החום, דוד צריך להיות ממוקם קרוב חדר ההקלטה ככל האפשר, באופן אידיאלי על במת המיקרוסקופ.
7. עם וסת זרימה להתאים את קצב הזרימה על 1 מ"ל / דקה.
8. חבר את האלקטרודה העליונה אל עמוד (שלילי) של 2 headstage באמצעות בעל אלקטרודה 2. לאגד בדיקה תרמי על האלקטרודה העליונה באמצעות טבעת O-. ודא טיפים האלקטרודה תרמי הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב למרכז הרשתית ככל האפשר. לטבול את קצה האלקטרודה העליונה בפתרון זלוף ולמקם אותו במרכז החדר. אפשר 10-15 דקות לייצוב הבסיס.
9. התאם את מתח DC של דוד, כך הטמפרטורה של הפתרון הוא 36 -37 ° C.

3. בידוד רשתית עכבר

1. תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר כהה מותאם עם CO ₂ ו פריקה צוואר הרחם. אופציונלי: להפוך את סימון ההפניה על גלגל העין בכל העכבר על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין עם עט או סיכה כויה לנתח מחוממת. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות ממירים תמונה אינפרא אדום בכושר מיקרוסקופ כדי לנתח.
2. לנתח את העיניים עם מספריים מעוגלות על ידי הפעלת לחץ עדין ומתיחת העור על הצדדים של כל עין. Hemisect שתי עיניים תחת תאורה אינפרא אדום באמצעות microscissors או סכין גילוח.
3. הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר גם של הזגוגית ככל האפשר.
4. פיל הרשתית 1 משכבת ​​אפיתל הפיגמנט, ואם יש צורך, לנקות ביסודיות עם מלקחיים כדי להסיר את גרגרי הנותרים של אפיתל הפיגמנט. אנחנו בדרך כלל באמצעות הרשתית כולה הן מוט חרוט transretinal הקלטות. עם זאת, אם אתם רוצים להקליט במיוחד מהחלק הגב של הרשתית העכבר כי יש יותר M / L-גביעי ^9, לפני קילוף הרשתית להסיר את החלק הגחוני של עיינית בסכין גילוח או microscissors באמצעות סימן כויה כנקודת התייחסות.
5. מניחים את גלגל העין hemisected 2 בצלחת פטרי קטנה עם פתרון הדגירה דגירה הכנה בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור עד לשימוש. בדרך כלל, בתנאים אלה עיינית העכבר 2 יכול להיות מאוחסן במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר ומשמש להקלטות.
6. בעזרת כוס או טפטפת פלסטיק להעביר את הרשתית בודד לירידה של פתרון זלוף (μl בקירוב 300) על מכסה של צלחת פטרי. להוסיף 5-6 טיפות קטנות של פתרון האלקטרודה המכילים BaCl ₂ עד הרשתית מראש דגירה עם BaCl _2. מניחים חתיכת ריבוע (5x5 מ"מ בקירוב) של הצד האחורי בפינה, משומנת (אנו משתמשים Dow Corning 111 סיכה השסתום איטום) Millipore מסנן נייר (0.45 מיקרומטר HARG סוג) עם חור מוכנות במרכזו (2-2.5 מ"מ קוטר) לירידה פתרון זהה. באמצעות עמדת מלקחיים הרשתית על גבי נייר סינון (בצד photoreceptor למעלה) ולחץ על הקצוות שלה בפריפריה כדי שטוח להעלות אותו. הרשתית יש מרוכז על פתיחת בעיתון הסינון.
7. שימוש במלקחיים להעביר את נייר הפילטר עם הרשתית לתא זלוף ומניחים אותו מעל גירוי במקום מיושר שטח אלקטרודה נמוכה יותר. קצת לחץ את הקצוות המשומנת של נייר פילטר לקשר את זה עם החדר.
8. מניחים את האלקטרודה העליונה מעל מרכז הרשתית (מעט לגעת שכבת photoreceptor). מרכוז האלקטרודה העליונה על הרשתית מגביר את משרעת האות (עד ~ 20-40% לעומת מיקומו קרוב יותר לקצה הרשתית). למרות מיקום האלקטרודה כך מעוות מעט אור יעיל גירוי בעוצמה להגיע מגזר קטן של הרשתית (~ 12-15% של השטח הכולל שלה), היא עדיין הדרך האופטימלית של הצבת electrode. הכנה מוכן כעת הקלטות transretinal.

4. Transretinal הקלטות

1. בהתאם לקו העכבר, להקליט או מוט M / L-חרוט מונחה פלאש התגובות הבדיקה מ עמום עוצמת אור בהירה מכויל 505 ננומטר הניתן מתוך מקור אור LED או ממריץ אופטי. במקרה של מקור אור LED שלנו, עוצמת הפלאש הוא נשלט על ידי שילוב של בקרה ממוחשבת של מתח הזנה LED, נגדים להחלפה, ומערכת של מסנני צפיפות ניטרלי (אנו משתמשים בצבע E-211 # 0.9 הסרט ND מסננים מ רוסקו מעבדות ) ממוקם בין LED לבין הרשתית. משך הבדיקה של ה-LED Flash (20 MS) נשלטת על ידי מחשב. אם באמצעות נורת הלוגן ממריץ אופטי, עוצמת המבחן פלאש הגל יכול להיות נשלט על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי או צרים הפרעה מסננים הלהקה, בהתאמה. משך הבדיקה פלאש יכול להיות נשלט על ידי מחשב מונעי התריסים.
2. אופציונלי: לשמירה יעילהדיכוי של הרכיב של גליה photoresponse עם BaCl ₂ לאורך כל היום, שנה את הפתרון אלקטרודה נמוכה מדי פעם (למשל, לפני בדיקה של כל הרשתית) על ידי מחיקת אותו באמצעות מזרק פלסטיק מלא פתרון טרי.

5. נציג תוצאות

פתרונות

1. הרשתית העכבר פתרון זלוף: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl _2, 1.2 מ"מ CaCl _2, 10 HEPES מ"מ (pH 7.2), 20 מ"מ NaHCO _3, 3 מ"מ succinate Na Na, 0.5 מ"מ גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. בנוסף, הפתרון הוא השלים עם 2 מ"מ L-גלוטמט ו 10 מיקרומטר DL-AP-4 לחסום רכיבים מסדר גבוה יותר של photoresponse ^10,11, עם 0.1% MEM ויטמינים ממ חומצות אמינו פתרונות (Sigma) כדי לשפר את הרשתית הכדאיות.
2. האלקטרודה פתרון עכבר: 140 מ"מ NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl _2, 1.2 מ"מ CaCl _2, 3 HEPES מ"מ (pH 7.4, NaOH). פתרון ele נמוכהשטח ctrode מכיל גם 2 מ"מ L-גלוטמט לחסום את ההולכה הסינפטית ^10, ובנוסף, 10 mM BaCl ₂ לדכא את הרכיב של גליה photoresponse ^3,12.
3. הדגירה פתרון הרשתית: להמיס 272 מ"ג L-15 בינוני (Sigma) ו - 20 מ"ג BSA במים 20 מ"ל deionized. סופי L-15 ריכוזי BSA הם 13.6 מ"ג / מ"ל ​​ו - 1 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. התאם את ה-pH 7.4 עם 1 M HCl.

באיור 1. תרשים סכמטי המציג את הבידוד של הרשתית העכבר על הקלטות transretinal ERG.

איור 2. צילום של החדר ואת זלוף אלקטרודות הקלטה עם מחזיקי שלהם. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף.

איור 3. תרשים תרשים סכמטי של הניסוי להקלטות transretinal ERG. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף.

. איור 4 תוצאות נציג: רשמה המשפחה של העכבר מוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים מייצגים ממוצעים של 5-6 תגובות בעוצמות האור העמום 2-3 ותגובות בעוצמות אור רוויי.

איור 5 תוצאות נציג:. משפחה מוקלט של העכבר חרוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים הם בסיס ממוצעes התגובות 5-10 בעוצמות האור העמום 3-5 ותגובות בעוצמות אור רוויי.

Discussion

שיטת מוט ו חרוט מונחה הקלטות transretinal ERG המתואר לעיל הופך כלי רב עוצמה על חקירת פונקציה של photoreceptors עכבר בסוג הן פראית בבעלי חיים מהונדסים גנטית. בנוסף לאפיון קל של נכסים photoresponse בסיסיים, טכניקה פשוטה זו מספקת יציבות בתגובה רבה במהלך לטווח ארוך ניסויים שבוצעו על קרוב אל שלמים ההכנות הרשתית. שניהם כהה להתאים אמפליטודה מוט בתגובה רגישות מירבית בעכברים מסוג בר יציבים בתוך לפחות 1h מתחילת הקלטות, ואת משרעת חרוט כהה להתאים רגישות מקסימאלית, ובדרך כלל לא לרדת יותר מ 10% לאחר 30-40 דקות של הקלטות. יתרונות נוספים של שיטה זו הם amenability שלה מניפולציות תרופתי קל כי הוא נגיש בכל תא יחיד הקלטות קלאסיות יניקה של photoreceptors עכבר, והיעדר הרדמה, נדרש ביצוע חי שיא ERG בעלי חייםings. באמצעות הרשתית של Tα ^{- / -} קו עכבר עם מוט לחסל איתות ⁸ להקלטות חרוט transretinal מקלה באופן משמעותי את שני ההליכים הניסוי ואת הפרשנות של התוצאות. הדבר חשוב במיוחד בניסויים שמטרתם ניטור העכבר חרוט פיגמנט ויזואלי התחדשות לאחר חשיפה תאורה בהירה ו / או ללמוד לתפקד חרוט בנוכחות אור רקע יציב. לכן, נקודות מבט מרגש חדשים נמצאים כעת לפתוח על חקירת המאפיינים הפיזיולוגיים של מוטות עכבר קונוסים, כולל מודלים העכבר להפרעות ראייה מוט ו חרוט בנושא.