我们描述了致敏的方法来确定胚后调节蛋白表达和定位<em> C。线虫</em>使用RNAi技术为基础的基因组的屏幕和一个综合的功能,荧光标记的蛋白质基因的表达。
线虫已被证明是一个有价值的发现和功能分析很多基因和基因途径1模型系统。在这个系统中的研究更先进的工具和资源,促进具有更微妙的表型或角色的基因的不断发现。
在这里,我们提出了一个广义的协议,我们确定C.适应利用RNAi的利益胚后表型线虫基因。这个过程很容易地修改,以检测表型的选择,无论光或荧光光学显微镜解剖或复合。此场次协议利用生物体的有形资产和C.分子工具线虫研究社会生产。作为一个例子,我们展示了一个综合的转基因表达的RNAi屏幕荧光产品的使用,以确定这是正常的本地化所需的基因产品在后期幼虫和成虫。首先,我们用全长cDNA插入市售的RNA干扰基因库。这个库有助于减少候选基因产品通过RNAi多个考生的快速识别。第二,我们产生了一个综合的利益我们fluorecently标签蛋白基因的表达RNAi敏感的背景。第三,暴露孵出的动物RNA干扰,这个屏幕允许有一个重要的胚胎的作用,否则屏蔽后胚胎的作用,在调节蛋白基因的产品鉴定。最后,该屏幕采用单细胞分辨率配备一个复合显微镜。
这里提出的RNAi筛选方法使胚后的表型正常(或基因)所需要的基因产物的敏感和快速分析。所示的例子是屏幕中的荧光标记的蛋白质的亚细胞定位有关的基因。然而,这项协议可以进行修改,以确定影响其他感兴趣的胚后表型的基因。
此方法采用候选基因的方法,通过使用RNA干扰库的优势。利用诱变技术正向遗传筛选确定随机引起的新的等位基因,这些等位基因需要大量时?…
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢里克·帕吉特博士(瓦克斯曼研究所,罗格斯大学,新泽西州)DBL-1基因和注射标记,博士,克里Rongo(瓦克斯曼研究所,罗格斯大学,新泽西州)的礼物。巴特格兰特博士的实验室进行基因枪轰击低拷贝数一体化的GFP标记DBL-1构造。勒内·加西亚实验室提供在创造texIs100技术援助。勒内·加西亚,罗宾Lints,李洪敏秦实验室提供了富有成效的意见。这项工作的启动资金是由TAMHSC从分子和细胞医学系。由部门和医学院院长办公室TAMHSC学院提供的资金购买该化合物的范围和旋转盘共聚焦。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |