We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie identificeren<em> C. elegans</em> Met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische scherm en een geïntegreerde transgen dat een functionele, fluorescent gelabeld eiwit tot expressie brengt.
C. elegans heeft zich bewezen als een waardevol model voor de ontdekking en functionele karakterisering van vele genen en pathways 1. Meer geavanceerde tools en middelen voor studies in dit systeem zijn het vergemakkelijken van voortdurende ontdekking van de genen met meer subtiele fenotypes of rollen.
Hier presenteren we een algemeen protocol waarin we aangepast voor het identificeren van C. elegans genen met postembryonic fenotypen van belang met behulp van RNAi 2. Deze procedure is eenvoudig aan te passen voor het testen van het fenotype van de keuze, hetzij door licht of fluorescentie optica op een dissectie of samengestelde microscoop. Deze screening protocol speelt in op de fysieke activa van het organisme en moleculaire technieken de C. elegans onderzoeksgemeenschap heeft geproduceerd. Als voorbeeld tonen we het gebruik van een geïntegreerde transgen een fluorescerend product uit in een RNAi scherm genen die voor normaal lokalisatie van deze identificatieproduct in een vergevorderd stadium larven en volwassenen. Eerst gebruikten we een commercieel verkrijgbare genomische bibliotheek met RNAi volle lengte cDNA-inserts. Deze bibliotheek vergemakkelijkt de snelle identificatie van meerdere kandidaten door RNAi vermindering van de kandidaat-genproduct. Ten tweede hebben we gegenereerd een geïntegreerde transgen dat onze fluorecently gelabeld eiwit van interesse uit in een RNAi-gevoelige achtergrond. Derde, door belichting gearceerde dieren RNAi, dit scherm kunnen herkennen genproducten die een belangrijke rol embryonale die anders zou maskeren postembryonale rol in het reguleren het eiwit van belang zijn. Tot slot, dit scherm maakt gebruik van een samengestelde microscoop uitgerust voor enkele cel resolutie.
De RNAi screening methode hier gepresenteerde zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van gen-producten die nodig zijn voor een normale (of transgene) postembryonic fenotype. Het voorbeeld is een scherm voor genen die betrokken zijn bij de subcellulaire lokalisatie van een fluorescent gelabeld eiwit. Toch kan dit protocol worden aangepast om genen die van invloed andere postembryonic fenotypen van belang vast te stellen.
Deze methode maakt gebruik van een kandidaat-gen benadering met behu…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Dr Rick Padgett (Waksman Instituut, Rutgers University, New Jersey) bedanken voor de gave van de DBL-1 cDNA en Dr Christopher Rongo (Waksman Instituut, Rutgers University, New Jersey) voor een injectie marker. Dr Barth Grant's lab uitgevoerd het gen pistool bombardement voor lage aantal kopieën integratie van de GFP-gelabelde dbl-1 construct. De Rene Garcia laboratorium technische bijstand verleend tijdens het maken van texIs100. De Rene Garcia, Robyn Lints en Hongmin Qin laboratoria die productief advies. Dit werk werd gefinancierd door het opstarten van middelen uit de TAMHSC Departement Moleculaire en Cellulaire Geneeskunde. De verbinding omvang en de draaiende schijf confocale werden aangekocht met geld van de afdeling en de TAMHSC College of Medicine bureau van de decaan.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |