Мы описываем чувствительный метод для выявления постэмбрионального регуляторов экспрессии белка и локализации<em> С. Элеганс</em> С помощью РНК-интерференции на основе геномных экран и встроенный трансгена, что выражает функциональный, помеченный флуоресцентной белка.
C. Элеганс оказалась ценной моделью системы для обнаружения и функциональные характеристики многих генов и генных пути 1. Более сложные инструменты и ресурсы для проведения исследований в этой системе, способствуют дальнейшей открытие генов с более тонким фенотип или ролей.
Здесь мы приводим обобщенный протокол мы адаптировали для выявления C. Элеганс генов постэмбрионального фенотипы интерес использование RNAi 2. Эта процедура легко модифицируется для анализа фенотипа выбор, будь то свет или флуоресценции оптики на вскрытии или составной микроскоп. Этот протокол обследования капитализирует на физические активы организма и молекулярные инструменты C. Элеганс научное сообщество произвел. В качестве примера мы демонстрируем использование интегрированных трансгена, что выражает флуоресцентного продукта в экран RNAi, чтобы идентифицировать гены, необходимые для нормальной локализации этогоПродукт в конце стадии личинки и взрослые. Во-первых, мы использовали коммерчески доступный геномный RNAi библиотека с полной кДНК вставки. Эта библиотека обеспечивает быструю идентификацию нескольких кандидатов RNAi снижение продукт гена кандидата. Во-вторых, мы получили интегрированную трансгена, что выражает наше fluorecently меченый белок в РНК-интерференции с учетом фона. В-третьих, подвергая вылупившихся животных РНК-интерференции, этот экран позволяет идентифицировать генные продукты, которые играют жизненно важную роль эмбриональные, которые могли бы скрыть постэмбрионального роль в регуляции белков, представляющих интерес. Наконец, этот экран используется сложный микроскоп оборудован для одной резолюции клетки.
Метод РНК-интерференции скрининга представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ генных продуктов, необходимых для нормальной (или трансгенных) постэмбрионального фенотипа. Пример приведен экран для генов, вовлеченных в субклеточные локализации флуоресцентной мече…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Рик Паджетт (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) за дар DBL-1 кДНК и д-р Кристофер ронго (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) для инъекций маркера. Лаборатории доктора Барта Гранта осуществляется бомбардировка генной пушки низкой интеграции номер копии GFP с метками DBL-1 конструкции. Рене Гарсиа лаборатория оказала техническую помощь в процессе создания texIs100. Рене Гарсиа, Робин Lints и Hongmin Цинь лабораторий, продуктивный совет. Эта работа финансировалась запуска средства TAMHSC Отдел молекулярной и клеточной медицины. Область соединения и вращается диск конфокальной было приобретено на средства, предоставленные отделом и TAMHSC Медицинского колледжа Деканат.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |