Détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus Maedi-visna qui exprime Green Fluorescent Protein

Résumé

Nous décrivons un clone moléculaire du maedi-visna qui exprime la GFP et est entièrement infectieuses. La réplication de ce virus peut être détecté en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux.

Résumé

Maedi-visna (MVV) est un lentivirus de moutons, provoquant lentement progressive pneumonie interstitielle et d'encéphalite ^1. Les cellules cibles primaires du MVV in vivo sont considérés comme des ² lignée des monocytes. Certaines souches de MVV peuvent se reproduire dans d'autres types cellulaires, toutefois ^3,4. La protéine fluorescente verte est un marqueur couramment utilisé pour étudier les lentivirus dans des cellules vivantes. Nous avons inséré le gène EGFP dans le gène codant pour dUTPase du MVV. Le gène dUTPase est bien conservée dans la plupart des souches de lentivirus des ovins et caprins et a été montré pour être important dans la réplication du CAEV ^5. Toutefois, dUTPase a été montré pour être dispensable pour la réplication du clone moléculaire de MVV utilisées dans cette étude in vitro et in vivo ^6. Réplication MVV est strictement limitée aux cellules de mouton ou de chèvre d'origine. Nous utilisons une lignée de cellules primaires de la choroïde de mouton du plexus (cellules SCP) pour la transfection et la propagation du virus ^7. La MVV fluorescente est entièrement infectieuses et expression de l'EGFP est stable pendant au moins six passages ^8. Il ya une bonne corrélation entre les mesures de DICT ₅₀ et EGFP. Ce virus devrait donc être utile pour la détection rapide des cellules infectées dans les études du tropisme cellulaire et la pathogénicité in vitro et in vivo ^8.

Protocole

1. La transfection

Le clone moléculaire est contenue dans deux plasmides, p8XSp5-EGFP et p67r, de 12 kb et 4,5 kb, respectivement ^9,10.

1. Couper des quantités équimolaires de deux plasmides, soit 4,4 mg d'p8XSp5-EGFP et 1,6 mg d'p67r par XbaI et ligaturer avant la transfection.
2. Pour la ligature, utilisez une unité de Weiss de ligase dans une réaction de 50 ul et incuber à 16 ° C pendant la nuit.
3. Lorsque la ligature est terminée, incuber le mélange de ligature à 65 ° C pendant 15 min pour l'inactivation de la ligase. Cette étape peut être omise.
4. Deux jours avant la transfection, les graines....

Discussion

La GFP exprimer clone moléculaire de MVV présentés ici devraient être utiles pour analyser les interactions de la cellule hôte et la pathogénicité du MVV fois in vitro et in vivo. Le virus obtenu après 7-14 jours de la réplication a incontestablement acquis une certaine mutations dues à l'imprécision de la transcriptase inverse. Cependant, il ya des limites à l'utilisation de ce clone comme un vecteur seul cycle. La première est que l'utilisation du clone est restreinte aux cellules de moutons et de chèvres .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
DMEM	Gibco	10938025
Opti-MEM	Gibco	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019