Summary
Nous décrivons un clone moléculaire du maedi-visna qui exprime la GFP et est entièrement infectieuses. La réplication de ce virus peut être détecté en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux.
Abstract
Maedi-visna (MVV) est un lentivirus de moutons, provoquant lentement progressive pneumonie interstitielle et d'encéphalite 1. Les cellules cibles primaires du MVV in vivo sont considérés comme des 2 lignée des monocytes. Certaines souches de MVV peuvent se reproduire dans d'autres types cellulaires, toutefois 3,4. La protéine fluorescente verte est un marqueur couramment utilisé pour étudier les lentivirus dans des cellules vivantes. Nous avons inséré le gène EGFP dans le gène codant pour dUTPase du MVV. Le gène dUTPase est bien conservée dans la plupart des souches de lentivirus des ovins et caprins et a été montré pour être important dans la réplication du CAEV 5. Toutefois, dUTPase a été montré pour être dispensable pour la réplication du clone moléculaire de MVV utilisées dans cette étude in vitro et in vivo 6. Réplication MVV est strictement limitée aux cellules de mouton ou de chèvre d'origine. Nous utilisons une lignée de cellules primaires de la choroïde de mouton du plexus (cellules SCP) pour la transfection et la propagation du virus 7. La MVV fluorescente est entièrement infectieuses et expression de l'EGFP est stable pendant au moins six passages 8. Il ya une bonne corrélation entre les mesures de DICT 50 et EGFP. Ce virus devrait donc être utile pour la détection rapide des cellules infectées dans les études du tropisme cellulaire et la pathogénicité in vitro et in vivo 8.
Protocol
1. La transfection
Le clone moléculaire est contenue dans deux plasmides, p8XSp5-EGFP et p67r, de 12 kb et 4,5 kb, respectivement 9,10.
- Couper des quantités équimolaires de deux plasmides, soit 4,4 mg d'p8XSp5-EGFP et 1,6 mg d'p67r par XbaI et ligaturer avant la transfection.
- Pour la ligature, utilisez une unité de Weiss de ligase dans une réaction de 50 ul et incuber à 16 ° C pendant la nuit.
- Lorsque la ligature est terminée, incuber le mélange de ligature à 65 ° C pendant 15 min pour l'inactivation de la ligase. Cette étape peut être omise.
- Deux jours avant la transfection, les graines de 10 6 cellules SCP dans un flacon de culture de tissu T25, et cultiver des cellules pour deux jours dans 5 ml de DMEM + 10% de sérum d'agneau et la glutamine 2 mM, sans antibiotiques pour une monocouche de 90% de confluence. Si les cellules n'ont pas atteint 90% de confluence, après deux jours, laissez les cellules à croître, une journée supplémentaire.
Remarque: Le sérum d'agneau peut être remplacé par du sérum de veau fœtal (FBS). Nous utilisons régulièrement l'agneau du sérum, car certaines souches de MVV sont inhibées par FBS; cette souche MVV n'est pas inhibée par FBS, cependant.
- Lorsque les cellules sont prêtes pour la transfection, le changement moyen du DMEM avec du sérum de 1% (sérum ou d'agneau FBS) sans antibiotiques.
Nous utilisons Lipofectamin 2000 (Invitrogen) pour la transfection. - Diluer l'ADN dans 500μl milieu Opti-MEM.
- Diluer 20 pi Lipofectamin 2000 dans 500μl milieu Opti-MEM et laisser à température ambiante (TA) pendant 5 min.
- Après l'incubation de 5 min, mélanger l'ADN dilué avec Lipofectamine diluée 2000 (volume total = 1000 pl). Mélanger doucement et incuber pendant 20-30 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de transfection (1 ml) à la fiole contenant des cellules T25 SCP et moyennes entreprises (5 ml). Mélanger en berçant doucement.
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 durant la nuit (18 - 24 h).
- Changer moyennes le jour suivant pour DMEM avec du sérum de 1%, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU 100IU.
- Surveiller la production de la GFP dans les cellules par microscopie fluorescente SCP inversé. Faible efficacité de la transfection peut s'attendre avec ces cellules primaires, généralement de 5 - 15%.
- Incuber encore à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant plusieurs jours afin de permettre la propagation du virus dans le ballon. Il prend habituellement 7-14 jours pour une infection complet.
- Récolte du virus par aliquotage le surnageant dans des tubes Eppendorf. Spin dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant contenant le virus à de nouveaux tubes. Conserver à -80 ° C.
2. Titrage du virus
- Graine 3x10 4 cellules SCP dans 100 pl de milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml, par puits dans une plaque à 96 puits. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Si les cellules sont confluentes le lendemain, changement de milieu de DMEM avec 1% de sérum, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml, 100 ul de chaque puits.
- Diluer le virus de la façon suivante:
- Ajouter 180 pl de DMEM avec du sérum de 1%, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml par puits à 4 x 10 puits dans un fond de 96 puits rond ou V-bottom assiette.
- Pour des dilutions en série décuplé en quatre exemplaires, ajouter 20 ul de virus à chaque 4wells dans la première colonne de la plaque, et en utilisant une pipette à quatre canaux, pipette haut et bas pour s'assurer que les échantillons soient bien mélangés. Changement des embouts de pipette et transférer 20 ul de la 4 prochaines puits et ainsi de suite. Laissez les derniers puits sans virus pour un contrôle négatif.
- Ajouter 100 ml de la dilution du virus aux cellules SCP et moyennes entreprises.
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Observer la fluorescence de la GFP et les effets cytopathiques pendant deux semaines.
Effets cytopathiques sont constitués de cellules deviennent arrondies et moins transparents que les cellules normales avec les processus qui s'étend, en terminant par les cellules apparaissant multinucléaire et la mort cellulaire. - Calculer le virus de titre (DICT50) en utilisant la méthode de Reed Muench 11.
3. Analyse FACS des cellules infectées
Note: Pour le suivi rapide de la réplication du virus, les cellules infectées peuvent être examinés par cytométrie en flux.
- Trypsiniser cellules infectées (environ 10 5), laver avec du PBS 1x et de remettre en suspension dans 500μl de PBS.
- Ajouter 500 ul solution de paraformaldéhyde à 4% (2% en concentration finale), incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Pellet cellules dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm pendant 5 min.
- Laver avec du PBS 2x5 min et d'analyser sur un analyseur FACScan. Comptez 10 000 événements.
4. Les résultats représentatifs:
Ce virus devrait être pleinement infectieuses et de répliquer à un titre de 10 juin à 10 juillet DICT 50 / ml. Les cellules infectées sont fluorescentes et peuvent être détecté par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. Typiquement, la GFP peut être détecté dans plus de 60% des cellules dans les cultures de cellules infectées en utilisant la cytométrie de flux (Fig. 1). De même, lorsque visualisé par microscopie à fluorescence, la majorité des cellules sont fluorescentes (figure 2A et B).
Figure 1. Analyse FACScan de cellules infectées par le SCP KV1772-EGFP virus après 7 jours d'infection.
Figure 2. Microscopie à contraste de phase de cellules infectées par le SCP KV1772-EGFP après 7 jours d'incubation (A). Mêmes cellules visualisées par microscopie à fluorescence (B).
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Discussion
La GFP exprimer clone moléculaire de MVV présentés ici devraient être utiles pour analyser les interactions de la cellule hôte et la pathogénicité du MVV fois in vitro et in vivo. Le virus obtenu après 7-14 jours de la réplication a incontestablement acquis une certaine mutations dues à l'imprécision de la transcriptase inverse. Cependant, il ya des limites à l'utilisation de ce clone comme un vecteur seul cycle. La première est que l'utilisation du clone est restreinte aux cellules de moutons et de chèvres d'origine. L'efficacité de transfection de ces cellules en utilisant notre construction est seulement 5-15%, et en utilisant un vecteur pEGFP-N3 l'efficacité de la transfection est de 15-20% comparé à plus de 90% en utilisant 293-T cellules. 293 cellules T ont été testés comme les cellules d'emballage pour les vecteurs de MVV, mais les particules de virus résultant prouvé non infectieuse à la fois dans les cellules de moutons et de 293 cellules T 12 probablement en raison de facteurs de restriction non identifiés. Le clone infectieux est contenu dans deux plasmides, qui est une autre lacune. Cela est dû au fait que le clone pleine longueur est instable dans E. coli. Cependant, il devrait être possible de cloner le clone pleine longueur dans une copie peu plasmide.
Plasmides et cellules peuvent être obtenues auprès des auteurs.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Fonds de recherche en islandais et l'Université d'Islande Fonds pour la recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10938025 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 51985018 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
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