הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

Summary

אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

Abstract

Maedi-visna וירוס (MVV) הוא lentivirus כבשים, גורם לדלקת ריאות ביניים מתקדמת לאט דלקת קרום המוח ^1. התאים היעד העיקרי של MVV in vivo נחשבים של ² את השושלת מונוציטים. זנים מסוימים של MVV יכול לשכפל סוגי תאים אחרים, לעומת זאת ^3,4. חלבון פלואורסצנטי ירוק הוא סמן הנפוץ לחקר lentiviruses בתאים חיים. אנחנו צריכים להכניס את הגן egfp לתוך הגן עבור dUTPase של MVV. הגן dUTPase נשמרת היטב זנים lentivirus ביותר צאן ו הוכח להיות חשוב שכפול של CAEV ^5. עם זאת, dUTPase הוכח להיות מיותר עבור שכפול של שיבוט מולקולרי של MVV השתמשו במחקר זה הן במבחנה in vivo ^6. שכפול MVV מוגבל אך ורק תאים של כבש או עז מוצא. אנו משתמשים בקו התא הראשוני של מקלעת דמית העין של כבשים (תאים SCP) עבור transfection ואת התפשטות של הנגיף ^7. MVV פלורסנט מדבק מלא הבעה EGFP יציב על לפחות 6 קטעים ^8. קיימת קורלציה טובה בין מדידות של TCID ₅₀ ו EGFP. וירוס זה ולכן צריך להיות שימושי עבור זיהוי מהיר של תאים נגועים במחקרים של כמיהות התא pathogenicity במבחנה in vivo ^8.

Protocol

1. Transfection

שיבוט מולקולרי נכלל בשני פלסמידים, p8XSp5-egfp ו p67r, של 12 קילו ו 4.5 kb בהתאמה. ^9,10

1. גזור כמויות equimolar של שני פלסמידים, כלומר 4.4 מיקרוגרם של p8XSp5-egfp ו -1.6 מיקרוגרם של p67r עם XbaI ו ולקשור לפני transfection.
2. עבור קשירת, השתמש וייס 1 יחידה של האנזים בתגובה 50 דגירה μl ובו 16 ° C במשך הלילה.
3. כאשר קשירת הושלמה, דגירה תמהיל קשירת על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עבור איון של האנזים. צעד זה עשוי להיות מושמט.
4. יומיים לפני, transfection זרע 10 SCP ⁶ תאים בקבוקון T25 תרבות רקמות, לגדל תאים יומיים 5 מ"ל DMEM + 10% בשר כבש בסרום גלוטמין 2mm ללא אנטיביוטיקה monolayer של 90% confluency. אם התאים לא הגיעו 90% confluency אחרי יומיים, לעזוב את התאים לגדול יום אחד נוסף.

הערה: סרום כבש ניתן להחליף על ידי עוברי בסרום שור (FBS). אנו משתמשים באופן שגרתי כבש בסרום, שכן כמה זנים של MVV מעוכבים על ידי FBS, זה זן MVV אינה מעוכבת על ידי FBS, עם זאת.

5. כאשר התאים מוכנים transfection, לשנות בינוני עד DMEM עם סרום 1% (טלה או בסרום FBS) ללא אנטיביוטיקה.
   אנו משתמשים Lipofectamin 2000 (Invitrogen) עבור transfection.
6. לדלל את ה-DNA בינוני Opti-ממ 500μl.
7. מדולל 20μl Lipofectamin 2000 במדיום Opti-ממ 500μl ומשאירים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
8. לאחר דגירה 5 דקות, לשלב את ה-DNA מדולל Lipofectamine בדילול 2000 (הנפח הכולל μl = 1000). מערבבים בעדינות דגירה של 20-30 דקות ב RT.
9. מוסיפים את תערובת transfection (1 מ"ל) ל T25 בקבוקון המכיל תאים SCP ובינוניים (5 מ"ל). מערבבים בעדינות על נדנדה.
10. לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ בלילה (18 - 24 ש).
11. שינוי יום בינוני הבאה כדי DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU פניצילין וסטרפטומיצין 100IU.
12. צג את הייצור של ה-GFP בתאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי SCP הפוכה. יעילות נמוכה transfection ניתן לצפות עם תאים ראשוניים אלה, בדרך כלל 5 - 15%.
13. דגירה נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך מספר ימים כדי לאפשר התפשטות של הנגיף בבקבוק. בדרך כלל לוקח 7-14 ימים עבור זיהום מלא.
14. קציר את הנגיף על ידי aliquoting supernatant לתוך צינורות Eppendorf. ספין microfuge בסל"ד 3000 דקות 5 להסיר את פסולת התא. מעבירים את supernatant המכילים את הנגיף כדי צינורות חדשים. חנות ב -80 ° C.

2. טיטרציה של הנגיף

1. זרעים 3x10 ⁴ תאים SCP בינוני 100 DMEM μl בתוספת סרום 10%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml, לכל היטב צלחת 96 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. אם התאים הם ומחוברות למחרת, לשנות בינוני עד DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml, 100 μl בכל טוב.
3. לדלל את הווירוס באופן הבא:
   1. הוסף 180 μl DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml לכל היטב 4 x 10 בארות בתחתית 96 עגול טוב או V-בתחתית הצלחת.
   2. עבור דילולים סדרתי פי עשרה ארבע פעמים, להוסיף 20 μl של הנגיף לכל אחד 4wells בעמודה הראשונה של הבסיס, באמצעות ארבעה ערוצים פיפטה, פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח כי דגימות מעורבבים היטב. שינוי עצות פיפטה והעברת 20 μl של 4 בארות הבא וכן הלאה. השאירו את בארות האחרון בלי וירוס עבור פקד שלילית.
4. הוסף 100 μl של דילולים הנגיף לתאים SCP ובינוניים.
5. לדגור על 37 ° C ו 5% CO _2. שימו לב ל-GFP הקרינה ותופעות cytopathic במשך שבועיים.
   תופעות Cytopathic מורכב של תאים הופכים מעוגל ושקוף פחות מאשר תאים נורמליים עם תהליכים מתמתח, וכלה בתאים multinuclear המופיעים ומוות התא.
6. חישוב וירוס titer (TCID50) בשיטת Muench ריד ^11.

3. FACS ניתוח של תאים נגועים

הערה: ניטור מהיר של שכפול הנגיף, תאים נגועים ניתן לבדוק על ידי cytometry הזרימה.

1. Trypsinize תאים נגועים (ca 10 ^5), לשטוף 1x עם PBS ו resuspend ב 500μl PBS.
2. הוסף 500 μl paraformaldehyde פתרון 4% (הריכוז הסופי 2%), דגירה על RT למשך 30 דקות.
3. גלולה תאים microfuge בסל"ד 3000 במשך 5 דקות.
4. לשטוף עם PBS 2x5 דקות ולנתח על נתח FACScan. ספירת 10,000 האירועים.

4. נציג התוצאות:

וירוס זה צריך להיות מדבק באופן מלא לשכפל כייל של יוני ¹⁰ - יולי 10 TCID ₅₀ / מ"ל. תאים נגועים הם פלורסנט ניתן Detected ידי cytometry זרימה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, GFP ניתן לאתר למעלה מ -60% של התאים בתרביות תאים נגועים באמצעות cytometry הזרימה (איור 1). כמו כן, כאשר דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, רוב התאים הם פלורסנט (איור 2A ו-B).

באיור 1. ניתוח FACScan של תאים נגועים בנגיף SCP-KV1772 egfp לאחר 7 ימים של זיהום.

2. איור שלב בניגוד מיקרוסקופית של תאים נגועים SCP-KV1772 egfp לאחר 7 ימי דגירה (A). תאים אותו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (B).

Discussion

GFP להביע שיבוט מולקולרי של MVV המוצגים כאן צריך להיות שימושי לניתוח מארח תאים אינטראקציות pathogenicity של MVV הן במבחנה in vivo. הווירוס מתקבל לאחר 7-14 ימים של שכפול רכשה ללא ספק כמה מוטציות עקב אי דיוק של reverse transcriptase. עם זאת, ישנן מגבלות על השימוש שיבוט זה כמו וקטור מחזור אחד. האחת היא השימוש המשובט מוגבל תאים של כבשים ממוצא עז. יעילות transfection של תאים אלה באמצעות לבנות שלנו הוא רק 5-15%, ושימוש וקטור pEGFP-N3 את היעילות transfection הוא 15-20% לעומת 90% מעל 293 משתמשים-T לתאים. 293-T לתאים נבדקו כמו תאים אריזות וקטורים MVV, אבל את חלקיקי הנגיף וכתוצאה מכך הוכיחו שאינם זיהומיות הן בתאים כבשים ב 293-T לתאים ¹² כנראה בגלל גורמים בלתי מזוהים הגבלה. שיבוט זיהומיות נכלל בשני פלסמידים, וזה עוד חיסרון. זאת בשל העובדה כי שיבוט באורך מלא, הוא לא יציב ב החיידק. עם זאת, זה צריך להיות אפשרי לשבט שיבוט באורך מלא בעותק נמוך פלסמיד.

פלסמידים ותאי ניתן לקבל המחברים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	10938025
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019