伝播と緑色蛍光タンパク質を発現Maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出

Summary

我々はGFPを発現し、完全に伝染性であるmaedi -ビスナウイルスの分子クローンを説明します。このウイルスの複製は、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて検出することができます。

Abstract

Maedi -ビスナウイルス（MVV）は徐々に進行性間質性肺炎や脳炎^1を引き起こして、羊のレンチです。 in vivoでのMVVの主要な標的細胞は単球系²のものであると考えています。 MVVの特定の菌株は、しかし^、3,4、他の細胞型で複製することができます。緑色蛍光タンパク質は、生きた細胞内でレンチウイルスを研究するための一般的に使用されるマーカーです。我々は、MVVのdUTPaseのための遺伝子にEGFP遺伝子を挿入した。 dUTPaseの遺伝子はよく羊とヤギの大部分のレンチウイルス株で保存されておりCAEV ⁵の複製に重要であることが示されている。しかし、dUTPaseは、in vitroおよびin vivo ⁶の両方本研究で使用したMVVの分子クローンの複製のためのなくても済むことが示されている。 MVVの複製は、厳密に羊やヤギ由来の細胞に限られている。我々は、トランスフェクションとウイルス⁷の増殖のための羊の脈絡叢（SCPの細胞）からの主な細胞株を使用してください。蛍光MVVは、完全に感染性であり、EGFPの発現は、少なくとも6通路⁸上安定しています。 TCID ₅₀とEGFPの測定値の間に良好な相関関係がある。このウイルスは、従って、in vitroおよびin vivo ⁸の細胞指向性や病原性の研究における感染細胞の迅速な検出に有用でなければなりません。

Protocol

1。トランスフェクション

分子クローンは、それぞれ12 kbと4.5kbの二つのプラスミド、p8XSp5 - EGFPとp67r、に含まれています^。9,10

1. 二つのプラスミド、すなわちp8XSp5 - EGFPの4.4μgのとトランスフェクションの前にXbaIおよびライゲーションとp67rの1.6μgの等モル量をカット。
2. ライゲーションの場合は、16℃で一晩50μlの反応とインキュベートでリガーゼの1ワイスのユニットを使用してください。
3. ライゲーションが完了すると、° Cリガーゼの活性化のための15分間65℃ライゲーションミックスをインキュベートする。このステップを省略してもよい。
4. 二日前にトランスフェクション、シード10 ⁶ SCPのT25組織培養フラスコ中の細胞、およびコンフルエント90％の単層に抗生物質なしで5ミリリットルDMEM + 10％子羊血清および2mMのグルタミンで2日間細胞を育てる。細胞が二日後にコンフルエント90％に達していない場合は、1つの追加の日成長する細胞を残す。

注：子羊の血清はウシ胎児血清（FBS）で置換することができます。 MVVの一部の菌株は、FBSにより阻害されるので、我々は日常的に、子羊血清を使用して、このMVV株は、しかし、FBSによって阻害されていません。

5. 細胞はトランスフェクションのための準備ができたら、抗生物質なしで1％の血清（子羊血清またはFBS）を含むDMEMに培地を変更してください。
   我々は、トランスフェクションのためにLipofectamin 2000（Invitrogen）を使用してください。
6. 500μLのOpti - MEM培地中でDNAを希釈する。
7. 500μLのOpti - MEM培地で20μlのLipofectamin 2000を希釈し、5分間室温（RT）で残す。
8. 5分のインキュベーション後、希釈したリポフェクタミン2000（合計量= 1000μL）で希釈したDNAを組み合わせる。穏やかに混合し、室温で20〜30分間インキュベートする。
9. SCPの細胞と培地（5 ml）を含むT25フラスコにトランスフェクション混合物（1ml）を追加します。静かに揺らして混合します。
10. 37 ° C、5％CO一夜_2（18 - 24時間）。
11. 1％の血清、2mMグルタミン、100IUペニシリンと100IUストレプトマイシンを含むDMEMに培地は、次の日を変更します。
12. 倒立蛍光顕微鏡によるSCPの細胞でGFPの生産を監視します。 15％ - 低いトランスフェクション効率は、通常5これらの初代培養細胞、と期待できる。
13. 37さらにインキュベート℃、5％フラスコ中でウイルスの拡散を可能にするために数日間のためのCO _2。それは通常、完全な感染の7〜14日かかります。
14. エッペンドルフチュー​​ブに上清を小分けしてウイルスを回収する。細胞破片を除去するために5分間3000rpmで遠心でスピン。新しいチューブにウイルスを含む上清を移す。 -80℃で保存する

2。ウイルスの滴定

1. 96ウェルプレートにウェルあたり、10％血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlのストレプトマイシンを添加した100μlのDMEM培地中でのシード3 × 10 ⁴ SCPの細胞を。 37℃、5％CO _2。
2. 細胞が次の日にコンフルエントな場合は、1％血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlのストレプトマイシン、各ウェルに100μlのDMEMに培地を変更してください。
3. 次の方法でウイルスを希釈する。
   1. 96ウェル丸底またはV底プレートに1％の血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlストレプトマイシンウェルあたりに4 × 10ウェルを180μlのDMEMを追加。
   2. 4部倍希釈系列の場合は、プレートの最初の列に4wellsのそれぞれにウイルス20μlを追加し、4チャンネルのピペットを使用して、サンプルが十分に混合されることを保証するために上下にピペッティング。ピペットチップを変更し、というように、次の4ウェルに20μlずつ移す。ネガティブコントロール用ウイルスなしで最後の井戸にしておきます。
4. SCPの細胞と培地にウイルス希釈液100μLを加える。
5. 37℃および5％CO _2をインキュベートする。二週間のためにGFP蛍光と細胞変性効果を観察する。
   細胞変性効果が丸いと多核出現細胞と細胞死で終わる、伸ばしプロセスとの正常な細胞よりも透明化細胞で構成されています。
6. リードMuench法^11を用いてウイルス力価（TCID50）を計算する。

3。感染した細胞のFACS分析

注：ウイルスの複製の急速な監視は、感染した細胞をフローサイトメトリーで調べることができます。

1. 感染細胞を（約10 ^5）トリプシン、500μLPBSでPBSに懸濁すると1Xを洗う。
2. 室温で30分間インキュベート500μlの4％パラホルムアルデヒド溶液（最終濃度2％）を、追加。
3. 5分間3000rpmで遠心で細胞をペレット化する。
4. PBS 2X5分で洗い、FACスキャン分析装置で分析する。 10,000のイベントを数える。

4。代表的な結果：

10 ⁷ TCID ₅₀ / mlの-このウイルスは完全に感染し、10 ⁶の力価に複製する必要があります。感染細胞は蛍光性であるとDETすることができますフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡法によるected。一般的に、GFPは、フローサイトメトリー（図1）を用いて感染細胞培養中の細胞の60％以上で検出することができます。同様に、蛍光顕微鏡で観察したとき、細胞の大多数は（図2AおよびB）蛍光灯です。

感染の7日後にKV1772 - EGFPウイルスに感染したSCPの細胞の図1。FACスキャン分析。

インキュベーションの7日間（）の後にKV1772 - EGFPを感染させたSCPの細胞の図2。位相差顕微鏡。同じ細胞は蛍光顕微鏡（B）により可視化。

Discussion

ここで提示MVVの分子クローンを表現するGFPは、宿主細胞の相互作用とin vitroおよびin vivoの両方MVVの病原性を解析するための有用なはずです。複製の7〜14日後に得られたウイルスは間違いなく、逆転写酵素の不正確さに起因するいくつかの変異を取得しています。しかし、単一サイクルのベクトルとしてこのクローンの使用に制限があります。一つは、クローンの使用は羊とヤギ由来の細胞に限定されていることです。私たちのコンストラクトを使用してこれらの細胞のトランスフェクション効率は5〜15パーセントであり、pEGFPを- N3ベクターを用いたトランスフェクション効率は293 - T細胞を用いて90％に比べて15から20パーセントです。 293 - T細胞は、MVVのベクトルのためのパッケージング細胞としてテストが、結果として得られるウイルス粒子は、羊の細胞と未確認の制約要因が原因と考えられます293 - T細胞の¹²の両方に非感染性が証明されている。感染性クローンは、別の欠点である二つのプラスミドに含まれています。これは、完全長クローンは大腸菌内で不安定であるという事実によるものです。しかし、それはプラスミド低コピーの完全長クローンのクローンを作成することができるはずです。

プラスミドと細胞は著者から入手することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	10938025
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019