Summary
Se describe un clon molecular del virus Maedi-visna que expresa GFP y es totalmente contagioso. La replicación de este virus puede ser detectado mediante el uso de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.
Abstract
Maedi-visna virus (MVV) es un lentivirus de ovejas, causando neumonía intersticial lentamente progresiva y encefalitis 1. Las células diana principal de MVV in vivo son considerados como una de las 2 linaje monocitos. Ciertas cepas de MVV puede replicar en otros tipos celulares, sin embargo, 3,4. La proteína verde fluorescente es un indicador comúnmente utilizado para el estudio de los lentivirus en las células vivas. Hemos insertado el gen EGFP en el gen de la dUTPase de MVV. El gen dUTPase está bien conservada en la mayoría de las cepas de lentivirus de ovejas y cabras y se ha demostrado que es importante en la replicación de CAEV 5. Sin embargo, dUTPase ha demostrado ser prescindible para la replicación del clon molecular de MVV utilizado en este estudio, tanto in vitro como in vivo 6. Replicación de MVV se limita estrictamente a las células de oveja o de cabra de origen. Nosotros usamos una línea celular primaria del plexo coroideo de oveja (células SCP) para la transfección y la propagación del virus de la 7. La MVV fluorescente es totalmente infecciosa y la expresión EGFP es estable durante al menos seis pasajes 8. Existe una buena correlación entre las mediciones de DICT 50 y EGFP. Este virus por lo tanto, debe ser útil para la detección rápida de las células infectadas en los estudios de patogenicidad y tropismo celular in vitro e in vivo 8.
Protocol
1. Transfección
El clon molecular está contenida en dos plásmidos, p8XSp5-EGFP y p67r, de 12 kb y 4,5 kb, respectivamente, 9,10.
- Corte cantidades equimolares de los dos plásmidos, es decir, 4,4 g de p8XSp5-EGFP y 1,6 g de p67r con XbaI y ligar antes de la transfección.
- Para la ligadura, utilice una unidad de Weiss de la ligasa en una reacción de 50 l, y se incuba a 16 ° C durante la noche.
- Cuando la ligadura se haya completado, se incuba la mezcla de ligación a 65 ° C durante 15 minutos para la inactivación de la ligasa. Este paso puede ser omitido.
- Dos días antes de la transfección, las semillas de 10 6 células SCP en un frasco de tejido T25 cultura, y hacer crecer las células durante dos días en 5 ml de DMEM + 10% de suero de cordero y glutamina 2 mM, sin antibióticos para una monocapa de 90% de confluencia. Si las células no han alcanzado el 90% de confluencia de dos días, dejar que las células crezcan un día más.
Nota: El suero de cordero puede ser sustituido por suero fetal bovino (FBS). Nosotros usamos cordero suero, ya que algunas cepas de MVV son inhibidas por el FBS; esta cepa MVV no es inhibida por el FBS, sin embargo.
- Cuando las células están listas para la transfección, el cambio medio DMEM con 1% de suero (suero o cordero FBS) sin antibióticos.
Usamos Lipofectamin 2000 (Invitrogen) para la transfección. - Diluir el ADN de 500μl Opti-MEM medio.
- Diluir 20μl Lipofectamin 2000 en 500μl Opti-MEM medio y dejar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Después de la incubación de 5 minutos, mezcle el ADN diluido con Lipofectamine diluida 2000 (volumen total = 1000 l). Mezclar suavemente e incubar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla de transfección (1 ml) al matraz que contiene las células T25 SCP y medio (5 ml). Mezclar por meciéndose suavemente.
- Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la noche (18 a 24 h).
- Cambio medio del día siguiente a DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU 100IU.
- Controlar la producción de GFP en las células SCP por microscopía de fluorescencia invertido. Baja eficiencia de transfección se puede esperar que con estas pilas, por lo general 5 a 15%.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante varios días para permitir la propagación del virus en el frasco. Por lo general, toma 7-14 días para la infección por completo.
- Recoger el virus de alícuotas del sobrenadante en tubos Eppendorf. Girar en una microcentrífuga a 3000 rpm durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante que contiene el virus de nuevos tubos. Almacenar a -80 ° C.
2. La titulación del virus
- Semillas de 3x10 4 células SCP en 100 l medio DMEM suplementado con suero al 10%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, por tanto en una placa de 96 pocillos. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Si las células son confluentes al día siguiente, el cambio medio DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l en cada pocillo.
- Diluir el virus de la siguiente manera:
- Añadir 180 l DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml por pozo de 4 x 10 pozos en un fondo de 96 ronda o la placa de fondo en V.
- Para diluciones seriadas diez veces en cuatro ejemplares, se añaden 20 l de virus a cada uno de 4wells en la primera columna de la placa, y con una pipeta de cuatro canales, pipeta hacia arriba y abajo para asegurarse de que las muestras estén bien mezcladas. Cambie la punta de la pipeta y la transferencia de 20 l para los próximos cuatro pozos y así sucesivamente. Dejar los pozos pasado sin virus durante un control negativo.
- Añadir 100 ml de las diluciones del virus a las células SCP y medianas empresas.
- Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2. Observar para la fluorescencia de GFP y efectos citopáticos por dos semanas.
Efectos citopáticos están formadas por células redondeadas y cada vez menos transparentes que las células normales con los procesos de estirar, para terminar con células multinucleadas que aparecen y la muerte celular. - Calcular el virus de título (TCID50) utilizando el método de Reed Muench 11.
3. FACS análisis de las células infectadas
Nota: Para el control rápido de la replicación del virus, las células infectadas pueden ser examinados por citometría de flujo.
- Trypsinize las células infectadas (aproximadamente 10 5), lavar con PBS 1x y se resuspenden en 500μl PBS.
- Añadir 500 l solución de paraformaldehído al 4% (2% de concentración final), se incuban a temperatura ambiente durante 30 min.
- Pellet células en una microcentrífuga a 3000 rpm durante 5 min.
- Lavar con PBS 2x5 min y analizar en un analizador FACScan. Contar con 10.000 eventos.
4. Los resultados representativos:
Este virus debe ser plenamente infecciosas y replicar a un título de 06 10 hasta 7 10 DICT 50 / ml. Las células infectadas son fluorescentes y se puede deteja por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Por lo general, las buenas prácticas agrarias pueden ser detectados en más del 60% de las células en los cultivos de células infectadas mediante citometría de flujo (Fig. 1). Del mismo modo, cuando se visualizan por microscopía de fluorescencia, la mayoría de las células son fluorescentes (Fig. 2A y B).
Figura 1. FACScan análisis de las células infectadas con el KV1772 SCP-EGFP virus después de 7 días de la infección.
Figura 2. Fase de microscopía de contraste de las células infectadas con el KV1772 SCP-EGFP después de 7 días de incubación (A). Las mismas células visualizado por microscopía de fluorescencia (B).
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Discussion
La GFP expresar clon molecular de MVV que aquí se presenta debe ser útil para el análisis de las interacciones de la célula huésped y la patogenicidad de MVV tanto in vitro como in vivo. El virus obtenido después de 7-14 días de la replicación, sin duda, ha adquirido algunas mutaciones debido a la inexactitud de la transcriptasa inversa. Sin embargo, hay limitaciones en el uso de este clon como un vector de ciclo único. Una de ellas es que el uso de la clonación se limita a las células de ovejas y cabras de origen. La eficiencia de transfección de estas células utilizando nuestra construcción es sólo un 5-15%, y el uso de un vector pEGFP-N3 la eficiencia de transfección es del 15-20% en comparación con más del 90% con 293-T las células. 293-T las células han sido probadas como las células de embalaje para los vectores de MVV, pero las partículas del virus que resulta probado no infecciosas, tanto en células de oveja y en 293 de las células T 12, probablemente debido a factores de restricción no identificados. El clon infeccioso se encuentra en dos plásmidos, que es otro defecto. Esto se debe al hecho de que el clon de larga duración es inestable en E. coli. Sin embargo, debería ser posible clonar el clon de longitud en una copia del plásmido bajo.
Plásmidos y las células se pueden obtener de los autores.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Fondo de Investigación de Islandia y la Universidad de Islandia Fondo de Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10938025 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 51985018 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
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