宣传和检测Maedi visna病毒传染性表达绿色荧光蛋白的分子克隆

Summary

我们描述了一个maedi visna病毒的分子克隆，表达GFP和充分传染病。这种病毒的复制，可以通过使用荧光显微镜和流式细胞仪检测。

Abstract

Maedi visna病毒量（MVV）是一个羊的慢病毒，引起缓慢渐进的间质性肺炎^和脑炎1。体内的MVV的主要靶细胞被认为是单^核细胞谱系2。某些菌株的MVV可以复制在其他类型的细胞，但是^3,4。绿色荧光蛋白是一种常用的标记用于研究活细胞的慢病毒。我们有MVV dUTPase基因插入的EGFP基因。 dUTPase基因是保守的绵羊和山羊的最慢病毒株，并已被证明是在^复制 CAEV 5重要。然而，dUTPase已被证明在此研究在体外和体内⁶使用的MVV分子克隆复制可有可无。 MVV复制是严格限制的绵羊或山羊的起源细胞。我们利用转染和传播病毒的⁷主要从羊的脉络丛（SCP的细胞）的细胞株。荧光灯的MVV完全传染病和EGFP表达稳定至少6通道^8。 TCID ₅₀和EGFP的测量之间有良好的相关性。因此，这种病毒应该被感染细胞的快速^检测 8，在体外和体内的细胞嗜性和致病性的研究非常有用。

Protocol

1。转

分子克隆两个质粒，p8XSp5 - EGFP和p67r 12 KB和450 KB，分别载于^9,10。

1. 剪下的两个质粒，即4.4微克p8XSp5 - EGFP转染前用XbaI和结扎和1.6微克p67r摩尔数量。
2. 结扎，使用50μl反应体系，在16 ° C过夜孵育1魏斯单位的连接酶。
3. 当结扎完成后，在65℃孵育15分钟连接酶失活结扎组合。这一步可以省略。
4. 转染前两天，种子10 ⁶ SCP的细胞在T25组织培养瓶中，并成长为这两天在5毫升的DMEM + 10％，羊肉和血清2MM谷氨酰胺抗生素而不到90％汇合单层细胞。如果细胞都没有达到90％汇合，两天后离开的细胞生长额外增加的一天。

注意：羊肉血清胎牛血清（FBS），可以取代。我们经常使用的羔羊血清，因为某些菌株的MVV FBS的抑制;这MVV应变是不抑制胎牛血清，但是。

5. 当细胞转染，改变1％血清的培养基（羊肉血清或胎牛血清）的DMEM无抗生素。
   我们用脂质体转染2000（Invitrogen）的。
6. 在500μL的Opti - MEM培养基稀释的DNA。
7. 在500μL的Opti - MEM培养基稀释20μL脂质体2000，并在室温（RT）5分钟离开。
8. 5分钟孵育后，用稀释的脂质体2000（总体积= 1000μL）稀释的DNA结合。轻轻混匀，并培育在室温为20-30分钟。
9. T25烧瓶中包含SCP的细胞和介质（5毫升）加入转染混合物（1毫升）。摇摆轻轻混合。
10. 37 ° C和5％的_{CO 2}晚（18 - 24小时） 。
11. 用1％的血清，2MM谷氨酰胺，青霉素100IU和100IU链霉素变化中DMEM翌日。
12. 监控生产绿色荧光蛋白在SCP细胞，倒置荧光显微镜。可以预计，随着这些主要细胞，一般为5 - 15％的转染效率低。
13. 在37进一步℃，5％的CO ₂几天烧瓶中，允许病毒的蔓延。它通常需要7-14天完全感染。
14. aliquoting Eppendorf管中的上清液的收获病毒。旋转5分钟3000转，在一个离心去除细胞碎片。转移上清含有病毒新管。储存在-80 ° C。

2。滴定病毒

1. 种子在100μL的DMEM培养基中血清10％，2MM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素，每孔在96孔板3x10 ⁴ SCP的细胞。在37℃，5％的CO _2。
2. 翌日，如果细胞融合，改变培养基DMEM培养液与1％血清，谷氨酰胺2MM，100IU/ml青霉素，链霉素100IU/ml，100μL，每孔。
3. 稀释下列方式病毒：
   1. 添加1％血清DMEM培养液180μL，2MM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素每孔4 × 10井在96圆底或V型底板。
   2. 一式四份串行十倍稀释，加20μL病毒4wells在该板块的第一列，并使用一个四道移液器，移液器上下，以确保样品充分混合。更改枪头和20μL转移到接下来的4口井等。离开病毒阴性对照去年井。
4. 添加100μL病毒稀释到SCP细胞和介质。
5. 孵育37 ° C和5％的CO _2。 GFP荧光和细胞病变的影响，观察了两个星期。
   细胞病变的影响变得圆润小于伸出过程中的正常细胞的透明度，以多核细胞和细胞死亡结束的细胞组成。
6. 计算病毒滴度（TCID50）使用的Reed Muench法^11。

3。流式细胞仪检测感染细胞的

注：对于病毒的复制快速监测，受感染的细胞可通过流式细胞仪检测。

1. Trypsinize（约10 ^5）感染的细胞，用PBS重悬在500μLPBS洗1X。
2. 添加500μL，4％多聚甲醛溶液（2％终浓度），在室温下孵育30分钟。
3. 在5分钟3000转离心沉淀细胞。
4. 2X5分钟，用PBS清洗和上FACScan分析仪进行分析。计数10,000个事件。

4。代表性的成果：

这种病毒应该充分感染和复制滴度的10月^6日 - 10 ⁷ TCID ₅₀ / ml的。感染的细胞荧光和可DETected流式细胞仪和荧光显微镜。通常情况下，GFP可以检测到超过60％被感染的细胞，用流式细胞仪（图1）文化细胞。同样，荧光显微镜观察时，大多数细胞荧光（图2A和B）。

图1。FACScan分析，感染后7天的SCP KV1772 - EGFP病毒感染的细胞。

图2。阶段KV1772 - EGFP感染后7天的潜伏期（一）SCP细胞的显微镜。相同的细胞荧光显微镜（二）可视化。

Discussion

这里介绍的MVV分子克隆的GFP表达，应有助于分析宿主细胞相互作用，并在体外和体内的MVV的致病性。复制后7-14天获得的病毒无疑已经收购了一些由于不准确的逆转录的突变。不过，也有作为一个周期载体使用这个克隆的限制。其中之一是限制使用克隆绵羊和山羊的起源细胞。使用我们的构造，这些细胞的转染效率只有5-15％，和使用的pEGFP - N3载体转染效率是15-20％相比，超过90％，使用293 - T细胞。 293 - T细胞的MVV载体的包装细胞进行了测试，但产生的病毒颗粒，证明非传染性绵羊细胞和293 - T细胞可能是由于身份不明的制约因素。感染性克隆是包含在两个质粒，这是另一弊端。这是由于这一事实，全长克隆在大肠杆菌中的不稳定。但是，它应该可以在低拷贝质粒克隆的全长克隆。

质粒和细胞可从作者。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	10938025
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019