Immunocytochemical identifisering av perifere sensoriske nerve fiber undergrupper (og påvisning av protein uttrykk der) er nøkkelen til forståelsen av molekylære mekanismene bak perifere sensasjon. Her vil vi beskrive metoder for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver, for eksempel hud og lemmer bein, for spesifikke farging av perifere sensoriske nervefibre.
Detection og primær behandling av fysiske, kjemiske og termiske sensoriske stimuli av perifere sensoriske nervefibre er nøkkelen til sensorisk persepsjon hos dyr og mennesker. Disse perifere sensoriske nervefibre uttrykker en mengde reseptorer og ion-kanalen proteiner som oppdager og initiere konkrete sensoriske stimuli. Metoder er tilgjengelige for å karakterisere de elektriske egenskapene av perifere sensoriske nervefibre innervating huden, som også kan benyttes til å identifisere funksjonelle uttrykket av spesifikke ionekanal proteiner i disse fibrene. Men lignende elektrofysiologiske metoder ikke er tilgjengelig (og er også vanskelig å utvikle) for påvisning av funksjonelle uttrykk av reseptorer og ion-kanalen proteiner i perifere sensoriske nervefibre innervating andre viscerale organer, inkludert de mest utfordrende vev som bein. Dessuten kan slike elektrofysiologiske metoder ikke kan benyttes til å bestemme uttrykket av ikke-hissige proteinS i perifere sensoriske nervefibre. Derfor gir farging av perifer / visceral vevsprøver for sensorisk nerve fivers best mulig måte å bestemme uttrykket av spesifikke proteiner av interesse i disse nervefibrene. Så langt har det meste av proteinet uttrykket studier i sensoriske nevroner benyttet farging prosedyrer i sensoriske ganglier, hvor informasjonen er begrenset til uttrykket av spesifikke proteiner i cellen kroppen av bestemte typer eller undergrupper av sensoriske nevroner. Her rapporterer vi detaljerte metoder / protokoller for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver for farging av perifere sensoriske nervefibre. Vi spesielt detalj metoder for utarbeidelse av hud eller plantar punch biopsi og bein (femur) seksjoner fra mus for farging av perifere sensoriske nervefibre. Disse metodene er ikke bare nøkkelen til kvalitativ måling av protein uttrykk i perifere sensoriske nevroner, men også gi en kvantitativ analyse metode forbestemme endringer i protein uttrykk nivåer i bestemte typer eller undergrupper av sensoriske fibre, samt for å bestemme morfologiske og / eller anatomiske endringer i antall og tetthet av sensoriske fibre under ulike patologiske tilstander. Videre er disse metodene ikke begrenset til farging av bare sensoriske nervefibre, men kan også brukes til farging noen typer nervefibre i hud, bein og andre visceral vev.
Her har vi detaljerte metoder for utarbeidelse av mus hud og benvev seksjoner for farging og påvisning av perifere sensoriske nervefibre. Delene produseres av plantar punsj biopsier inneholder både snau og hårete hud, noe som betyr at protokollen kan brukes på alle hudtyper. Disse teknikkene kan også brukes til å stain andre celletyper i disse vev (f.eks leukocytter, vaskulær endothelia, glatt muskulatur blant annet). Disse metodene gir et utmerket kompromiss mellom optimal ultrastructural bevaring (som oppnås v…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker dr. Yuriy M. Usachev for hans hjelp i den innledende standardisering av konfokalmikroskopi / avbildning av mus plantar punch biopsi farging, og Dr. Donna L. Hammond for hennes videre hjelp og konstruktiv kritikk i dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra NINDS / NIH (NS069898), og en idéutvikling Grant Award fra Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) til DPM
Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |