カルモジュリン(CaM)プルダウンアッセイは、様々なタンパク質とカルモジュリンの相互作用を調査するために効果的な方法です。このメソッドは、CAM -結合タンパク質の効率的かつ特定の分析のためのCaM -セファロースビーズを使用しています。これは、細胞機能のCAM信号を探索するための重要なツールが用意されています。
カルシウム(Ca 2 +)は、さまざまなメカニズムを通じて細胞機能の調節に重要なイオンで す。多くのCa 2 +のシグナリングは、カルモジュリン(CaM)1,2として知られているカルシウム結合タンパク質によって媒介される。 CAMは、アポトーシス、代謝、平滑筋収縮、シナプス可塑性、神経の成長、炎症と免疫応答を含むほぼすべての細胞プロセス、内の複数のレベルで関与している。タンパク質の数は、CAMとの相互作用を介してこれらの経路を調節するのに役立ちます。これらの相互作用の多くは、Ca 2にバインドされたときに明らかに異なっているCAMのコンフォメーション、+(のCa 2 + – CaMの)としてのCa 2 + -フリー状態(ApoCaM)3とは対照的に依存する。
ほとんどの標的タンパク質は、Ca 2 + – CaMのをバインドしながら、特定のタンパク質だけApoCaMに結合する。ニューロ4、ニューログラニン(呉)5、および特定のミオシンを含む彼らのIQ -ドメインを介して、いくつかのバインドCAM、 <sup> 6。これらのタンパク質はそれぞれ、前シナプス機能7、シナプス機能8、および筋収縮9の重要な役割を果たすことが示されている。結合し、Ca 2 +の存在下または存在下でCAMをリリースする+能力は、それらの機能に極めて重要である。対照的に、多くのタンパク質は唯一のCa 2 + – CaMの結合し、それらの活性化のため、このバインディングを必要とする。例としては、ミオシン軽鎖キナーゼ10のCa 2 + /カルモジュリン依存性キナーゼ(CaMKs)11とホスファターゼ(例えばカルシニューリン)12、及び直接的および下流効果14のバリエーションがスペクトリンキナーゼ13を 、含まれています。
細胞機能に対するこれらのタンパク質の効果は、通常のCa 2 +依存的にCAMに結合する能力に依存しています。例えば、我々は、シナプス機能とどのように異なる突然変異は、この結合に影響を与えるのNG – CaMの結合の妥当性をテストした。我々は、GFPタグ付き伍CONを生成のCa 2 +依存的にCAMをバインドするために呉の能力を変更するようなIQ -ドメイン内の特定の変異を持つ構造体。これらの異なる突然変異の研究は、シナプス機能8,15に関与する重要なプロセスに私たちに偉大な洞察力を与えた。しかし、このような研究で、それは変異タンパク質が予想されるのCaMへの結合を変更していることを証明するために不可欠です。
ここで、我々は、例としてCaMKIIとngを使用して、Ca 2 +の存在下または非存在下でCAMに結合するタンパク質の能力をテストするための手法を提案する。このメソッドは、CaMとプルダウンアッセイと呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーの形です。それは、CaMと+この結合に対するCa 2 +の影響に結合するタンパク質をテストするためのCaM -セファロースビーズを使用しています。それは、効率的なかなり多くの時間であり、カラムクロマトグラフィーおよび他のアッセイの相対少ない蛋白質を必要とします。完全に、これはでているのCa 2 + /カルモジュリンのシグナル伝達やタンパク質を探索するために貴重なツールを提供します。CAMとteract。
提供するプロトコルは、CAM -結合蛋白質のCa 2 + -依存性を調査するようにCAM -セファロースビーズを利用しています。多くのタンパク質は、Ca 2 +依存的にカルモジュリンを結合する。これらの相互作用は、多くのシグナル伝達経路におけるカルモジュリン結合タンパク質およびそれらの重要な役割の数は与えられた非常に重要です。このプロトコルでは、CAM -セファロースビー?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、このプロトコルを最適化する上で彼女の助けでティファニーチェリーに感謝したいと思います。この作品は、国立老化研究所(AG032320)だけでなく、健康なウィスコンシン州を進めることによって資金を供給された。