Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l'interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d'explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.
Le calcium (Ca 2 +) est un ion essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire à travers une variété de mécanismes. Beaucoup de Ca 2 + de signalisation est médiée par la protéine liant le calcium connu comme la calmoduline (CaM) 1,2. Cam est impliqué à plusieurs niveaux dans presque tous les processus cellulaires, y compris l'apoptose, le métabolisme, la contraction des muscles lisses, la plasticité synaptique, la croissance des nerfs, l'inflammation et la réponse immunitaire. Un certain nombre de protéines aident à réguler ces voies grâce à leur interaction avec la CaM. Beaucoup de ces interactions dépendent de la conformation de came, qui est nettement différente lorsqu'il est lié à Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) par opposition à sa Ca 2 + sans état (ApoCaM) 3.
Alors que la plupart des protéines cibles se lient Ca 2 +-CaM, certaines protéines ne se lient à ApoCaM. Certains CaM lient par leur QI-domaine, y compris neuromodulin 4, neurogranine (Ng) 5, et certaines myosines <sup> 6. Ces protéines ont été montré à jouer un rôle important dans la fonction présynaptique 7, fonction postsynaptique 8 et 9 contraction des muscles, respectivement. Leur capacité à se lier et libérer Cam en l'absence ou la présence de Ca 2 + est le pivot de leur fonction. En revanche, de nombreuses protéines ne se lient Ca 2 +-CaM et nécessitent cette liaison pour leur activation. Les exemples incluent la myosine kinase à chaîne légère 10, Ca 2 + / CaM-kinases dépendantes (CaMKs) 11 et les phosphatases (par exemple la calcineurine) 12, et la spectrine kinase 13, qui ont une variété d'effets directs et aval 14.
Les effets de ces protéines sur la fonction cellulaire sont souvent dépendants de leur capacité à se lier à Cam dans un Ca 2 +-dépendante. Par exemple, nous avons testé la pertinence de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la façon dont les mutations affectent différentes cette liaison. Nous avons généré une con-GFP taggés Ngstruct avec des mutations spécifiques dans le IQ-domaine qui allait changer la capacité de se lier Ng CAM dans une Ca 2 +-dépendante. L'étude de ces différentes mutations nous a donné une grande perspicacité dans les processus importants impliqués dans la fonction synaptique 8,15. Cependant, dans de telles études, il est essentiel de démontrer que les protéines mutées ont altéré la liaison prévue à Cam.
Ici, nous présentons une méthode pour tester la capacité des protéines à se lier à Cam en présence ou en absence de Ca 2 +, en utilisant CaMKII et Ng comme exemples. Cette méthode est une forme de chromatographie d'affinité appelé CaM déroulant dosage. Il utilise la CaM-Sépharose perles de tester les protéines qui se lient à came et l'influence de Ca 2 + sur cette liaison. Il est temps considérablement plus efficace et nécessite moins de protéine par rapport à la chromatographie colonne et d'autres épreuves. Au total, cela donne un outil précieux pour explorer Ca 2 + de signalisation Cam / et de protéines que dansteract avec Cam.
Le protocole fourni utilise CaM-sépharose perles pour enquêter sur le Ca 2 +-dépendance de la CaM des protéines de liaison. De nombreuses protéines se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Ces interactions sont d'une grande importance étant donné le nombre de CaM des protéines de liaison et leur rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation. Dans ce protocole, Cam-sépharose perles sont utilisées pour séparer des protéines de liaison de la CaM d'homogénat de tissu en …
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Tiffany cerise dans son aide à l'optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par l'Institut national du vieillissement (AG032320) ainsi que l'avancement une meilleure santé du Wisconsin.
Product | Company | Catalogue number | Notes |
Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |