Calmodulina (CaM) pull-down saggio è un modo efficace per studiare l'interazione del CAM con varie proteine. Questo metodo utilizza CaM-sefarosio perle per l'analisi efficiente e specifica di CaM proteine leganti. Questo fornisce un importante strumento per esplorare segnalazione CaM in funzione cellulare.
Calcio (Ca 2 +) è uno ione fondamentale nella regolazione della funzione cellulare attraverso una varietà di meccanismi. Gran parte del Ca 2 + segnalazione è mediato attraverso la proteina legante il calcio conosciuto come calmodulina (CaM) 1,2. CaM è coinvolta a più livelli in quasi tutti i processi cellulari, tra cui l'apoptosi, il metabolismo, la contrazione della muscolatura liscia, la plasticità sinaptica, la crescita dei nervi, l'infiammazione e la risposta immunitaria. Un certo numero di proteine aiutano a regolare queste vie attraverso la loro interazione con la CaM. Molte di queste interazioni dipende dalla conformazione della CAM, che è nettamente diverso quando si lega al Ca 2 + (Ca 2 +-Cam), in opposizione alla sua Ca 2 + libero stato (ApoCaM) 3.
Mentre la maggior parte delle proteine bersaglio legano Ca 2 +-CAM, solo alcune proteine si legano ai ApoCaM. Alcuni CaM si legano attraverso il loro IQ-dominio, tra cui neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e alcuni miosine <sup> 6. Queste proteine hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella funzione presinaptica 7, funzione post-sinaptici 8, e la contrazione muscolare 9, rispettivamente. La loro capacità di legare e rilasciare CaM in assenza o in presenza di Ca 2 + è fondamentale nella loro funzione. Al contrario, molte proteine si legano solo Ca 2 +-CAM e necessitano di questo legame per la loro attivazione. Gli esempi includono miosina chinasi della catena leggera 10, Ca 2 + / CaM chinasi-dipendenti (CaMKs) 11 e fosfatasi (ad esempio calcineurina) 12, e spettrina chinasi 13, che hanno una varietà di effetti diretti ed a valle 14.
Gli effetti di queste proteine sulla funzione cellulare dipendono spesso dalla loro capacità di legarsi al CaM in Ca 2 +-dipendente. Per esempio, abbiamo testato la rilevanza di Ng-CAM obbligatorio in funzione sinaptica e di come diverse mutazioni influenzano questa associazione. Abbiamo generato un GFP-tagged con Ngstruct con mutazioni specifiche nel IQ-dominio che avrebbe cambiato la capacità di Ng di legare CaM in Ca 2 +-dipendente. Lo studio di queste mutazioni diverse ci ha dato grande intuizione in importanti processi coinvolti nella funzione sinaptica 8,15. Tuttavia, in tali studi, è essenziale per dimostrare che le proteine mutate hanno atteso il legame alterato per CAM.
Qui vi presentiamo un metodo per testare la capacità delle proteine di legarsi al CaM in presenza o in assenza di Ca 2 +, con CaMKII e Ng come esempi. Questo metodo è una forma di cromatografia di affinità indicato come un pull-down assay CaM. Utilizza CaM-Sepharose perline per testare le proteine che si legano CaM e l'influenza di Ca 2 + su questa associazione. E 'molto più tempo efficiente e richiede meno proteine rispetto alla cromatografia su colonna, ed altri test. Complessivamente, questo fornisce un valido strumento per esplorare Ca 2 + / CaM e proteine di segnalazione che interact con CaM.
Il protocollo fornito utilizza CaM-sefarosio perline per indagare il Ca 2 +-dipendenza di CaM proteine leganti. Molte proteine si legano CaM in Ca 2 +-dipendente. Queste interazioni sono di grande importanza dato il numero di proteine che legano CaM e il loro ruolo fondamentale in molte vie di segnalazione. In questo protocollo, Cam-sefarosio perline vengono utilizzate per separare CaM-binding proteins da tessuto omogenato in presenza o in assenza di Ca 2 +. I risultati…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Tiffany Cherry nel suo aiuto per ottimizzare questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Aging (AG032320) così come Avanzando un più sano Wisconsin.
Product | Company | Catalogue number | Notes |
Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |