Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.
Cálcio (Ca 2 +) é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca 2 + de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina 1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) em oposição à sua Ca 2 + estado livre (ApoCaM) 3.
Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca 2 +-CaM, algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e miosinas certos <sup> 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica 7, função pós-sinápticos 8, e 9 a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca 2 + é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca 2 +-CaM e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina 10, Ca 2 + / CaM quinases dependentes (CaMKs) 11 e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) 12, e espectrina quinase 13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante 14.
Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca 2 + forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca 2 + forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica 8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM.
Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca 2 +, usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca 2 + em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca 2 + / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.
O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca 2 + dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca 2 + forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca 2 +.</su…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Tiffany Cereja em sua ajuda na otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Aging (AG032320), bem como Avançando um Wisconsin saudável.
Product | Company | Catalogue number | Notes |
Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |