钙调蛋白(CAM)下拉实验调查与各种蛋白质的CaM的相互作用的有效途径。此方法使用效率和具体分析CaM结合蛋白钙调素琼脂糖珠。这提供了一个重要的工具,探索细胞功能的CAM信号。
钙( 钙离子)离子通过多种机制调节细胞功能的重要。大部分的Ca 2 +信号是通过介导的钙结合蛋白称为钙调蛋白(CAM) 1,2。 CAM是涉及多层次的,在几乎所有的细胞过程,包括细胞凋亡,代谢,平滑肌收缩,突触可塑性,神经生长,炎症和免疫反应。的蛋白质,帮助调节与CAM的互动关系,通过这些途径。许多这些相互作用依赖于CaM的构象,这是明显不同的CA 2 +(的Ca 2 + – CAM)作为反对它的Ca 2 +自由状态(ApoCaM)3时,势必。
虽然大多数靶蛋白结合的Ca 2 + – CAM,某些蛋白质只能绑定到ApoCaM。有的通过他们的智商域绑定CAM,包括neuromodulin的NG(NG)5,4,和一定的肌球蛋白<sup> 6。这些蛋白质已被证实,分别在突触前功能性突触后功能8,和肌肉的收缩9发挥的重要作用。他们的结合能力,并释放钙的缺乏或存在的 CAM +是在其功能的关键。相比之下,许多蛋白质结合的Ca 2 + – CAM,并要求其激活这个约束力。例子包括肌球蛋白轻链激酶10的Ca 2 + / CaM依赖的蛋白激酶(CaMKs)11和磷酸酶(如钙调磷酸酶)12,和血影蛋白激酶13,其中有各种直接和下游的影响14。
这些蛋白质对细胞功能的影响往往依赖于自己的能力结合到CAM中的Ca 2 +依赖性。例如,我们测试的NG – CAM约束力的突触功能的相关性和不同的基因突变如何影响这个约束力。我们生成一个GFP标记的吴CON结构与特定的突变,在IQ域会改变伍CAM中的Ca 2 +依赖性的结合能力。这些不同的基因突变的研究给了我们很大的启示,为参与突触功能的8,15的重要进程。然而,在这些研究中,它是必不可少的证明突变的蛋白质有约束力凸轮预期改变。
在这里,我们目前为检测蛋白质的能力绑定到CAM的Ca 2 +的存在或缺乏,作为例子使用CaMKII和NG方法。这种方法是一种亲和层析的形式简称为CAM的下拉检测。它使用的CaM -琼脂糖珠测试蛋白质结合CAM与此绑定的Ca 2 +的影响。这是相当多的时间效率和需要较少的蛋白质相柱层析及其他实验。总之,这提供了一个宝贵的工具,以探索的Ca 2 + / CaM的信号和蛋白质,在teract与CAM。
提供的协议利用CaM的琼脂糖珠调查的Ca 2 +依赖CaM结合蛋白。许多蛋白质结合CAM中的Ca 2 +依赖性。这些相互作用CaM结合蛋白的数量和他们的许多信号通路中的关键作用给予高度重视。在这个协议中,CAM – Sepharose树脂用于组织匀浆中的Ca 2 +的存在或缺乏独立于CaM结合蛋白。这个简单的方法的结果将进一步了解蛋白质如何与CAM中的Ca 2 +依赖的方式进行交互。这种方?…
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢她的帮助下,在优化这个协议蒂芙尼樱桃。这项工作是由国家衰老研究所(AG032320)以及推进健康威斯康星州。