Summary
Быстрый способ проведения иммунной из рыбок данио сердце эмбриональных описано. По сравнению с весь подход иммуноокрашивания гору, этот метод значительно увеличивает проникновение антител, что позволяет получать изображения с высоким разрешением, которые показывают сотовой / субклеточных структур в сердце в течение намного сократить время обработки.
Abstract
Данио рерио эмбрион становится популярным в модельном позвоночных естественных условиях для изучения развития сердечных и человеческих пороков сердца благодаря своему выгодному эмбриологии и генетики 1,2. Около 100-200 эмбрионов легко доступны каждую неделю от одной пары взрослых рыб. Прозрачные эмбрионы, которые развивают бывшие внутриутробно делают их идеальными для оценки пороки сердца 3. Выражением какого-либо гена можно манипулировать с помощью морфолино технологии или РНК инъекций 4. Более того, вперед генетические экраны уже сформирован список мутантов, которые затрагивают различные перспективы cardiogenesis 5.
Всего иммуноокрашивания крепление важная техника в этой животной модели выявить экспрессии целевого белка в определенной ткани 6. Тем не менее, изображения с высоким разрешением, которые могут раскрыть клеточный или субклеточных структур, было трудно, в основном за счет физических нахоионного сердца и бедных проникновение антител.
Здесь мы представляем метод для решения этих узких мест, анализируя сердца, а затем проводят окрашивание процесс на поверхности стекло микроскопа. Для предотвращения потери небольших образцов сердце и облегчить решение обработки, мы ограничили сердце образцов в круг на поверхности предметные стекла, запряженной immEdge пера. После окрашивания, сигналов флуоресценции можно непосредственно наблюдать соединение микроскопа.
Наш новый метод значительно улучшает проникновение на наличие антител, так как сердце от эмбриональных рыбу только состоит из нескольких слоев клеток. Высокое качество изображения с нетронутыми сердца могут быть получены в значительно снижается процессия время для рыбок данио эмбрионов в возрасте от 2-й день за днем 6. Наш метод может быть потенциально распространяться на другие органы пятно расчлененный либо из рыбок данио или других мелких животных.
Protocol
1. Подготовка слайдов и влажной камере
- Влажной камере могут быть сделаны из окна, такие как опустели наконечник коробки. Оберните обе камеры и накрыть алюминиевой фольгой для защиты образцов от света месте.
- Внутри камеры, поставить кучу мокрой бумажные полотенца для поддержания влажности воздуха внутри камеры, что позволит предотвратить сердце образцы от высыхания. Установите небольшой планшет на вершине бумажное полотенце в качестве стойки для слайдов.
- Ничья либо линии или круги на поверхности стекло микроскопа использованием immEdge перо, чтобы сделать скважины для сердца образцы с диаметром около 5х5 мм. Пусть слайды сухой.
- Положите слайды в увлажненной камере и добавить свежие 50ul 4% формальдегида в каждую лунку.
2. Препарирование эмбрионального сердца
- Обезболить рыбы эмбриона в яйце E3 воды 7, содержащий 0,4% tricaine в течение приблизительно 1 минуты, пока рыба движение тела остановить, но до сих пор нормальное сердцеизбиение.
- Положите вогнутой слайд микроскопа на этапе вскрытия микроскопом. Трансфер эмбрионов вогнутую хорошо.
- Настройте свет сочетание рассекает микроскопом, чтобы четко выявить сердце. В зависимости от личных предпочтений, это может быть либо темном поле или ДВС-поляризованным, как состояние света.
- Чистая два шприца инсулина с 75% этанола, а затем сухой.
- Отрегулируйте рассечение микроскопом, чтобы лупы с большим увеличением и сосредоточиться на сердце. Физически исправить эмбриона, вставив один кончик иглы в желтке сомитов граница близко к голове. Вставьте другую иглу близко к области сердца и вытащить сердце из быстро. Если сердце не полностью отделены от эмбриона, отрезать оставшиеся ткани связаны между сердцем и желток.
- Настройте микроскоп, чтобы меньшее увеличение и сосредоточиться на разделенных сердце. Используйте 10 мкл pipetteman и установите его в 1 мкл объема. Применить кончик pipetteman либо нарисовать или сенсорныйСердце образца, так что изолированное сердце будет либо внутри, либо прикреплены к поверхности наконечника.
- Dip пипетки в 4% раствор формальдегида на подготовленных слайдов и нажмите пипетки поршня, чтобы освободить душу в решение. Натяжение водной поверхности также помогает освободить сердце от кончика пипетки в раствор. Положите менее 3 сердца в каждую лунку.
3. Иммуноокрашивание
- Закрыть камеру и положил его на шейкере со спокойным движением раскачивания. Fix сердца образца в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Вытрите воду на задней слайды и поместить слайды на этапе вскрытия микроскоп для буфера обмена.
- Опустите наконечник от 10 мкл pipetteman в пустую область в каждую лунку и держать кончик как можно дальше от сердца образцов. Возьмите предупреждает, чтобы избежать сердце присоединения к кончику, так как сердце может двигаться с потоком воды, когда раствор втягивается в наконечник. Изменениенаконечник локализации, если это необходимо.
- Утилизировать раствор на ткань и избежать любого производства пузырьков в наконечник с образцом сердце легко теряется при наличии пузырьков воздуха. Хранение образцов сердце частично высохнуть в течение короткого времени может помочь сердца пребывания прилагается к слайдам.
- Добавить 50 мкл PBST для покрытия сердце образца и инкубировать в увлажненной камере в медленное движение качалки в течение 5 мин. Повторите промыть еще раз. После этого шага, сердце образцы могут быть сохранены в увлажненной камере до 1 недели при температуре 4 ° C.
- Блок сердца образца с 10% овечьей сыворотки в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте сердца образца с первичными антителами, такие как разведение 1:200 β-катенина антител и 1:200 разбавление Mef2 специфических антител, в 10% овечьей сыворотки / PBST в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте сердце образца с PBST в три раза (5 мин. Каждого) при комнатной температуре.
- Инкубируйте образца со среднимантитела, такие как разведение 1:1000 Alexa-меткой анти-мышь и / или анти-кролика антитела, в PBST в течение 0,5 часа.
- Вымойте сердце образцов с PBST в три раза (5 мин. Каждого) при комнатной температуре.
4. Изображений
- Удалить PBST и добавить 10 мкл монтажа среду в каждую лунку. Рок камеры в течение нескольких минут, пока раствор становится ясно.
- Удаление большей части монтажа средних и охватывать все скважин в один слайд с стекло микроскопа крышкой (24x50).
- Изображение рыбы сердца, используя Zeiss Axioplan 2 микроскоп с ApoTome (Carl Zeiss).
5. Представитель Результаты
Пример изображения, которое показывает, мембраны и ядра всех рыбок данио кардиомиоцитов показано на рис. 1. mef2c и β-катенина антитела используются вместе, чтобы пятно сердца образцы расчлененное из 52 эмбрионов данио HPF. Хотя mef2c пятна антител ядер кардиомиоцитов, β-катенинаантител показывает границы каждой ячейки 8-10. Регулируя этап сложного микроскопа, изображение сердца образцов может быть настроен на ту же ориентацию, что позволит наблюдения внешних кривизны и внутренней кривизны в сердце 11. Общее количество кардиомиоцитов, кардиомиоцитов размер ячейки, а округлость может быть измерена.
Другой пример, который показывает саркомерных структуры эмбрионального сердца показана на рис. 2. Мы провели иммуноокрашивания использованием F59, антитела миозин, в расчлененное эмбрионального сердца. Сеть миофибрилл в целом эмбрионального сердца может быть четко выявлены на более низких увеличение, в то время как поперечно-полосатой полоса толстой нити могут быть выявлены при большем увеличении (рис. 2) 6.
Рисунок 1. Иммуноокрашивание из Mef2 (красный) и β-катенина (зеленый), чтобы показать ядер и outlИнес кардиомиоцитов в желудочке рыбок данио. Шкала бар = 10 мкм
Рисунок 2. Immnostaining миозина, чтобы показать толстую нить в данио желудочка при любом малом увеличении () или большим увеличением (B). Шкала бар = 10 мкм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с классическими методами иммунной целом горе, наш метод имеет следующие преимущества. Во-первых, гораздо сильнее, флуоресцентные сигналы могут быть последовательно получены благодаря улучшению проникновения. В целом метод иммунной горы, плотной ткани кожи вокруг сердца значительно уменьшается проникновение много антител, что приводит к высоким фоном во всем теле. Эта проблема особенно серьезна для эмбрионов старше 3-дневный после оплодотворения (DPF). В противоположность этому, расчлененный сердца состоять только из нескольких слоев клеток, что делает намного лучше проникновения. Во-вторых, из-за значительно улучшилось проникновение, весь процесс иммунной может быть снижена с 1 дня до всего несколько часов. Мы добились снижения времени инкубации от 1 часа до 30 минут для некоторых антитела, такие как актинина, Integin связанных киназы (ILK) и β-катенина специфических антител. В-третьих, изображения с высоким разрешением могут быть получены из последовательно нетронутыми сердцавыявить сотовой / субклеточных информации. Из-за локализации сердце внутри перикардиальный мешок, который находится рядом с желтком, выше линзы увеличения цель не может быть использована для изображения нетронутыми эмбрионов. Таким образом, сердце должны быть расчлененным, если образ нетронутым сердцем не требуется. Тем не менее, моющие средства, такие как тритон-х-100, которые используются для улучшения проникновения в целом процедура окрашивания крепление ослабить эмбрионов. Как следствие, сердце легко ломаются во время вскрытия процедуры. В противоположность этому, живое сердце гораздо сильнее, который может быть легко отделен от соседних тканей. Таким образом, нетронутыми морфологии легче поддерживать использование предложенного метода. Хотя рассекает маленькое сердце данио может показаться сложной, большинство людей может легко проводить эту процедуру после нескольких практик.
Мы использовали этот метод, чтобы пятно сердца в возрасте от 2 до 6 денье DPF. Из-за своего физического местоположения, даже сердца от графафурье поставил эмбрионов трудно анализировать. Это еще предстоит определить, является ли этот метод может быть настроен для личинки или взрослого сердца. Стоит отметить, что местное повреждение сердца может привести во время вскрытия процесс, который включает в себя физическую силу. Это осложнение может быть преодолена путем оценки нескольких сердцах, а затем выбрав изображения с согласованные результаты и наилучшим образом обеспечивается морфологии.
Из-за значительно улучшенное разрешение, этот метод может быть использован как выявить клеточные и субклеточные структуры развивающихся данио сердце. Например, мы уже применили этот метод для подсчета общего количества кардиомиоцитов, дать количественную оценку отдельных размер кардиомиоцитов, для оценки пролиферации и апоптозе, и выявить процесс сборки саркомера 6,12. Вместе с уникальными генетическими инструментами данио рерио, данный способ будет способствовать изучению сердечно-сосудистой биологии в этой модели в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Beninio Jomok за помощь в данио хозяйства. Эта работа финансируется NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
