Summary
Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.
Abstract
Zebravis embryo wordt een populair in vivo vertebrate model voor het bestuderen van ontwikkeling van het hart en het menselijk hart-en vaatziekten als gevolg van de gunstige embryologie en genetica 1,2. Ongeveer 100-200 embryo's zijn verkrijgbaar elke week vanaf een enkel paar van de volwassen vissen. De transparante embryo's ex utero ontwikkelen maken ze ideaal voor de beoordeling van hartafwijkingen 3. De expressie van een gen kan worden gemanipuleerd via morfolino technologie-of RNA-injectie 4. Bovendien, naar voren genetische screens hebben al een lijst van mutanten die verschillende perspectieven van cardiogenese 5 beïnvloeden.
Whole mount immunokleuring is een belangrijke techniek in dit diermodel om de expressie patroon van de beoogde eiwit openbaren aan een bepaald weefsel 6. Echter, hebben een hoge resolutie beelden die kunnen onthullen cellulaire of subcellulaire structuren is moeilijk, vooral als gevolg van de fysieke location van het hart en de slechte penetratie van de antilichamen.
Hier presenteren we een methode om deze knelpunten aan te pakken door het ontleden van het hart en vervolgens het uitvoeren van de kleuring proces op het oppervlak van een microscoop dia. Om het verlies van kleine monsters het hart te voorkomen en om de oplossing te hanteren te vergemakkelijken, beperken wij het hart monsters binnen een cirkel op het oppervlak van de microscoop dia's getrokken door een immEdge pen. Na de kleuring, kan de fluorescentie signalen direct worden waargenomen door een samengestelde microscoop.
Onze nieuwe methode verbetert de penetratie voor antilichamen, want een hart van een embryonale vis slechts bestaat uit enkele cellagen. Beelden van hoge kwaliteit uit intacte hart kunnen worden verkregen binnen een veel lagere processie tijd voor zebravis embryo's de leeftijd van dag 2 tot dag 6. Onze methode kan mogelijk worden uitgebreid naar andere organen ontleed van zowel zebravis of andere kleine dieren vlek.
Protocol
1. De voorbereiding van dia's en vochtige kamer
- De bevochtigde kamer kan worden gemaakt van een doos, zoals een leeg tip box. Wikkel zowel de kamer en het afdekken met aluminiumfolie om de monsters te beschermen tegen licht.
- In de kamer, zet een stapel natte papieren zakdoekjes om de vochtigheid in de kamer, die het hart monsters te voorkomen dat het drogen te behouden. Stel een klein microplaat op de top van de papieren handdoek als een rek voor de dia's.
- Teken of lijnen of cirkels op het oppervlak van een objectglaasje met behulp van de immEdge pen om putten te maken voor het hart monsters met een afmeting ongeveer 5x5 mm. Laat de dia's drogen.
- Zet de dia's in de bevochtigde kamer en voeg 50ul verse 4% formaldehyde in elk putje.
2. Dissectie van embryonale hart
- Verdoven de vissen embryo in E3 ei water zeven met 0,4% tricaïne voor ongeveer 1 minuut tot de vis te stoppen beweging van het lichaam, maar hebben nog steeds normaal hartkloppen.
- Doe een concave microscoopglaasje op het podium van een dissectie microscoop. Breng de embryo's naar de uitgehold goed.
- Pas de lichte combinatie van de dissectiemicroscoop om duidelijk te openbaren het hart. Afhankelijk van persoonlijke voorkeur, kan het zowel donker veld of DIC-achtige gepolariseerd licht.
- Schoon twee insuline-injectiespuiten met 75% ethanol, dan droog.
- Stel de dissectie microscoop naar hogere vergroting en zich richten op het hart. Fysiek stelt een embryo door het invoegen van een naald in de dooier-somiet grens dicht tegen het hoofd. Plaats een andere naald dicht bij het hart streek en trek het hart snel uit. Als het hart niet volledig gescheiden van het embryo, afgesneden van de rest verbonden weefsel tussen het hart en de dooier.
- Stel de microscoop om lagere vergroting en zich richten op de gescheiden hart. Gebruik een 10μl pipetteman en stel deze in op 1μl volume. Breng de tip van de pipetteman om ofwel te trekken en raak hethart monster, zodat het geïsoleerde hart zal zijn, hetzij binnen of aan het oppervlak van de tip.
- Dompel de pipetpunt in 4% formaldehyde-oplossing op voorbereid dia's en druk de pipet zuiger naar het hart introductie in de oplossing. De spanning van het wateroppervlak helpt ook om het hart bevrijden van pipettip aan de oplossing. Zet minder dan 3 harten in elk putje.
3. Immunokleuring
- Sluit de tank af en zet het op een shaker met een zachte wiegende beweging. Bevestig het hart monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Veeg het water aan de achterzijde van de dia's en zet de dia's op het podium van een dissectie microscoop voor het uitwisselen van buffer.
- Dompel de tip van een 10μl pipetteman in een leeg gebied in elk putje en houd de punt zo ver mogelijk van het hart monsters. Neem de waarschuwingen om te voorkomen dat het hart verbonden aan de tip, want harten zou kunnen bewegen met de waterstroom wanneer de oplossing wordt getrokken in de tip. Veranderingde tip lokalisatie, indien nodig.
- Gooi de oplossing op een tissue en vermijd het produceren van alle belletjes in de punt, omdat het hart monster wordt gemakkelijk verloren in de aanwezigheid van luchtbellen. Houden van het hart monsters gedeeltelijk droog voor een korte tijd kan helpen de harten aangesloten blijven op de dia's.
- Voeg 50μl PBST naar het hart monster te dekken en in de bevochtigde kamer in een langzame schommelende beweging gedurende 5 minuten incuberen. Herhaal het spoelen nog een keer. Na deze stap kan het hart monsters worden opgeslagen in de bevochtigde kamer maximaal 1 week bij 4 ° C.
- Blokkeer het hart monster met 10% schapen serum in PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer het hart monster met primaire antilichamen, zoals 1:200 verdunning van β-catenine antilichaam en 1:200 verdunning van mef2 specifiek antilichaam, in 10% schapen serum / PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het hart monster met PBST drie keer (5 min.. Elk) bij kamertemperatuur.
- Incubeer het monster met secundaireantilichamen, zoals 1:1000 verdunning van Alexa-gelabeld anti-muis en / of anti-konijn antilichamen, in PBST gedurende 0,5 uur.
- Was het hart monsters met PBST drie keer (5 min.. Elk) bij kamertemperatuur.
4. Imaging
- Verwijder PBST en voeg 10 ul montage medium aan elke well. Rock de kamer voor een aantal minuten tot de oplossing helder wordt.
- Verwijder het grootste deel van de montage-medium en alle van de putten in een dia met een microscoop afdekglas (24x50).
- Afbeelding vis hart met behulp van Zeiss Axioplan 2 microscoop uitgerust met apotome (Carl Zeiss).
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een beeld dat membraan en kernen van alle zebravis hartspiercellen onthult wordt getoond in Fig. 1. mef2c en β-catenine antilichamen werden gebruikt samen aan het hart monsters ontleed van 52 hpf zebravis embryo vlek. Terwijl mef2c antilichaam vlekken de kernen van cardiomyocyten, β-catenineantilichaam onthult de rand van elke cel 8-10. Door het aanpassen van de fase van de samengestelde microscoop, kunnen beelden van het hart monsters worden aangepast aan de dezelfde richting, waardoor de waarneming van uiterlijke en innerlijke kromming kromming in het hart 11 zal toestaan. Het totale aantal cardiomyocyten, cardiomyocyt celgrootte, en circulariteit kan dan worden gemeten.
Een ander voorbeeld dat de sarcomeer structuur van een embryonale hart laat zien is te zien in Fig. 2. We voerden immunokleuring met behulp van F59, een myosine antilichaam, in een ontleed embryonale hart. De myofibril netwerk in een hele embryonale hart kan duidelijk worden onthuld bij lagere vergroting, terwijl de gestreepte band van dik filament kan worden onthuld bij hogere vergroting (afb. 2) 6.
Figuur 1. Immunokleuring van mef2 (rood) en β-catenine (groen) om de kernen en OutL tonenines van de cardiomyocyten in een zebravis ventrikel. Schaalbalk = 10μm
Figuur 2. Immnostaining van myosine aan de dikke gloeidraad in een zebravis ventrikel show in ofwel een lage vergroting (A) of hoge vergroting (B). Schaal bar = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vergelijking met klassieke ganse berg immunokleuringen methoden, onze methode heeft de volgende voordelen. Ten eerste kan veel sterker fluorescerende signalen consequent worden verkregen dankzij de verbeterde penetratie. In de ganse berg immunokleuring methode, de dichte huid weefsel rondom het hart aanzienlijk verminderd de penetratie van vele antilichamen, wat resulteert in hoge achtergrond in het hele lichaam. Dit probleem is vooral ernstig voor embryo's ouder dan drie-dagen post-bevruchting (DPF). In tegenstelling, de opengesneden harten alleen uit een paar cellagen, waardoor veel betere penetratie. Ten tweede, als gevolg van de sterk verbeterde penetratie, kan het hele proces van immunohistochemie worden verlaagd van 1 dag tot slechts enkele uren. We hebben met succes verminderde de incubatietijd van 1 uur tot 30 minuten voor een aantal antilichamen zoals actinine, Integin-linked kinase (Ilk) en β-catenine specifieke antilichamen. Ten derde, hoge resolutie beelden kunnen consistent worden verkregen uit intacte hartom cellulaire / subcellulaire informatie te onthullen. Omwille van de lokalisatie van het hart in de pericardiale zak, dat is naast de dooier, kan een hogere vergroting objectieven niet worden gebruikt om de afbeelding intact embryo's. Daarom zal het hart moeten worden ontleed als beelden van een intact hart nodig zijn. Echter, detergenten zoals Triton-X-100 die gebruikt worden om de penetratie te verbeteren in de hele berg kleuringsprocedure de embryo's te verzwakken. Als gevolg daarvan zijn hart gemakkelijk gebroken tijdens de dissectie procedure. In tegenstelling, een live-hart is veel sterker, dat gemakkelijk kan worden gescheiden van de naburige weefsels. Daarom zijn intact morfologie meer gemakkelijk te onderhouden met behulp van de voorgestelde methode. Hoewel ontleden een klein zebravis hart kan lijken uitdagend, kunnen de meeste mensen gemakkelijk te voeren van deze procedure na een aantal praktijken.
Wij hebben gebruikt deze methode harten leeftijd van 2 tot 6 DPF DPF vlek. Door zijn fysieke locatie, harten van zelfs earlIer geënsceneerde embryo's zijn moeilijk te ontleden. Het moet nog worden vastgesteld of deze methode kan worden aangepast voor de larven of volwassen harten. Het is de moeite waard om erop te wijzen dat de lokale schade aan het hart kan leiden tijdens de dissectie proces, waarbij fysieke kracht meebrengt. Deze complicatie kan worden verholpen door het beoordelen van een aantal harten, en vervolgens selecteren van beelden met consistente resultaten en de best onderhouden morfologie.
Door de sterk verbeterde resolutie, kan deze methode worden gebruikt om zowel cellulaire en subcellulaire structuren van een zich ontwikkelende zebravis hart te onthullen. Zo hebben we al deze methode toegepast op het totale aantal cardiomyocyten tellen, om individuele cardiomyocyten grootte te kwantificeren, om de proliferatie en apoptose te beoordelen, en om het proces van sarcomeer assemblage 6,12 onthullen. Samen met de unieke genetische tools in zebravis, de huidige werkwijze zal de studie van cardiovasculaire biologie te vergemakkelijken in deze in vivo model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Beninio Jomok voor zijn hulp in de zebravis veehouderij. Dit werk wordt gefinancierd door NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
