Summary
一个快速的方式来进行免疫的斑马鱼胚胎心脏描述。整装免疫方法相比，这种方法大大增加渗透的抗体，这使得获取高分辨率图像，揭示了心脏细胞/亚细胞结构内大幅减少处理时间。
Abstract
斑马鱼的胚胎成为在体内的脊椎动物模型研究心脏发育和人类心脏疾病，由于其优越的胚胎学和遗传学1,2的流行。约100-200胚胎都是现成的，每周从一对成鱼。开发前子宫内的透明胚胎，使他们理想的评估心脏缺陷3。通过吗啉技术或RNA注射4的任何基因的表达可以被操纵。此外，遗传筛选已经产生的突变体，影响不同的角度cardiogenesis 5 。
整个装载免疫组化是一个重要的技术在这种动物模型揭示的目标蛋白质的表达模式，以一个特定的组织 6 。然而，高清晰度的图像，可以揭示细胞或亚细胞结构已经很难，主要是由于物理locat离子的心脏和较差的抗体渗透。
在这里，我们目前通过解剖心脏载玻片表面上，然后再进行染色过程中的一个方法来解决这些瓶颈。为了防止小心脏样品的损失，并促进解决方案的处理，我们限制在一个圆圈上immEdge笔绘制表面的显微镜幻灯片心脏样本。染色后，可直接观察到的荧光信号的复合显微镜。
我们的新方法显着提高抗体的渗透，因为从一个胚胎的鱼心脏只有几个细胞层组成。年龄从2天到6天的斑马鱼胚胎内大幅减少的游行时间从完整的心可以得到高质量的图像。我们的方法可以潜在地扩展到染色无论从斑马鱼或其他小动物解剖的其他器官。
Protocol
1。幻灯片的制备和湿盒
- 湿盒，可从一个盒子为空的提示框等。包装室和用铝箔盖，以保护样品从光。
- 箱内，放了一堆湿纸巾保持室内的湿度，防止干燥的心脏样本。设置上的纸毛巾作为幻灯片的机架顶部的小微孔板。
- 在表面的显微镜幻灯片使用immEdge笔关于采用5x5 mm的尺寸与心脏样本井要么绘制线或圆形。让幻灯片干燥。
- 湿盒中的幻灯片，并添加50ul新鲜的4％，每口井的甲醛。
2。胚胎心脏解剖
- 在E3鸡蛋的水中含有约1分钟，直至鱼停止身体运动0.4％tricaine麻醉鱼胚胎，但仍然有正常的心脏跳动。
- 凹显微镜幻灯片放在一个解剖镜下阶段。凹形以及胚胎转移。
- 调整清楚地揭示了心脏的解剖显微镜的光组合。根据个人喜好，它可以是暗场或DIC样偏振光条件。
- 两个胰岛素注射器用75％乙醇的清洁，然后晾干。
- 解剖镜下调整到更高的放大倍率和心脏的重点。身体修复的胚胎，卵黄体节的边界，接近头部插入一个针头。插入另一针靠近心脏地区，并迅速拉心脏。如果心脏是没有完全从胚胎中分离出来，切断连接心脏和蛋黄之间的剩余组织。
- 调整显微镜低倍率和分离心脏的焦点。使用加入10μlpipetteman，将其设置为加入1μl体积。应用pipetteman的一角，可以借鉴或触摸心脏样本，使离体心脏内或针尖表面。
- 浸在准备幻灯片4％的甲醛溶液中的吸头和压低吸管活塞释放到溶液中心脏。水的表面张力也有助于释放的心脏从枪头的解决方案。少装比3，在每口井的心中。
3。免疫染色
- 关闭室，并放在一个振动筛用温和的摇摆运动。修复心脏样品在室温下20分钟。
- 后面的幻灯片上的水擦去，并把幻灯片上的一个缓冲交换的解剖镜下阶段。
- 浸在每口井从加入10μlpipetteman到一个空地区的一角，并尽可能保持心脏样品的提示。采取警告，以避免心脏附加给小费，因为心可能与水流移动时的解决办法是绘制成尖。更改提示本地化，如果需要的话。
- 处置到一个组织的解决方案，避免产生任何气泡，在尖，因为心脏样本很容易失去气泡的存在。保持心脏样本部分干很短的时间，可以帮助保持连接到幻灯片的心。
- 加入50μLPBST覆盖的心脏样品，并培育在湿盒在5分钟的摇摆运动缓慢。重复冲洗更多的时间。这一步后，心脏样本，可以存储在湿盒1周在4 ° C
- 座与10％PBST羊血清在室温下1小时的心脏样本。
- 与初级抗体，如β- catenin抗体，1:200稀释1:200稀释MEF2特异性抗体，孵育心脏样本，10％的羊血清/ PBST在室温下1小时。
- 洗PBST三次在室温下（5分钟）的心脏样本。
- 二次孵育样品1:1000稀释Alexa的，标签的反鼠标和/或抗兔抗体，如抗体，在PBST为0.5小时。
- 用PBST洗三次心脏样本（5分钟）在室温下。
4。成像
- 取出PBST，每孔加10μL安装介质。摇滚室几分钟，直到解决方案变得清晰。
- 取出安装介质，并涵盖所有的水井在一个用显微镜盖玻片（24x50）的幻灯片。
- 图片鱼的心脏，使用蔡司Axioplan 2显微镜配备ApoTome（卡尔蔡司）。
5。代表性的成果
如图图像显示所有斑马鱼心肌细胞的细胞膜和核的一个例子。 1。 MEF2C和β-连环蛋白抗体染色52 HPF斑马鱼胚胎解剖心脏样本一起使用。虽然MEF2C抗体污渍，β- catenin的心肌细胞的细胞核抗体显示的每个细胞8-10边境。通过调整阶段的复式显微镜，图像的心脏样本，可以进行调整，以相同的方向，这将允许外曲率和曲率在心脏 11内观察。然后可以测量总的心肌细胞数量，心肌细胞大小和圆。
另一个例子，它揭示的一个胚胎的心脏横纹肌结构如图。 2。我们进行了免疫使用的F59，肌球蛋白抗体，胚胎心脏在解剖。在一个整体的胚胎心脏肌原纤维网络，可以清楚地表明在较低的放大倍率，而粗丝纹状波段可显示在更高的放大倍率（图2）6 。
图1。MEF2（红色）和β-连环蛋白（绿色）免疫染色显示细胞核和OUTLINES在斑马鱼心室的心肌细胞。比例尺=10μm的
图2。肌球蛋白Immnostaining显示在斑马鱼心室粗丝或低倍率（A）或（二）高倍率比例尺=10μm的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们的方法，以经典的整装免疫组化方法相比，具有以下优点。首先，可以始终获得更强的荧光信号由于提高普及率。在整个装载免疫方法，密集的皮肤组织周围的心脏显著减少许多抗体的渗透，在高背景导致整个身体。这个问题严重，特别是对超过3天受精后（DPF）的胚胎。相比之下，解剖心中只由几个细胞层，呈现更好的渗透。其次，由于已大为改善渗透，全过程的免疫可以减少从1天到只有几个小时。我们已经成功地减少孵育时间从1小时到30分钟，一些辅，Integin连接激酶（ILK），和β- catenin的特异性抗体，如抗体。第三，高清晰度的图像可以始终获得完整的心揭示细胞/细胞内信息。由于内心脏的心包囊，蛋黄旁边的本地化，不能用于高倍率物镜完整的胚胎形象。因此，心脏将需要进行解剖，如果需要一个完整的心脏图像。然而，如TRITON - X - 100，是用来改善整个装入染色过程中的渗透，削弱胚胎洗涤剂。因此，心中都在清扫过程中容易破碎。相反，一个活的心脏是强得多，可以很容易地从邻近组织分开。因此，完整的形态，更易于维护使用方法。虽然解剖可能会出现一个小的斑马鱼心脏具有挑战性的，大多数人可以很容易地进行此过程后几种做法。
我们已经利用这种方法染色心中年龄从2 DPF岁至6 DPF。由于其物理位置，甚至伯爵心中IER上演，胚胎难以解剖。这仍有待确定这个方法是否可以调整为幼虫或成年心中。这是值得指出的是，当地的心脏的损害可能会导致在清扫的过程，它涉及的物质力量。这种并发症是可以克服的评估几个的心，然后选择图像一致的结果，并保持最佳的形态。
由于大大改善了决议，这种方法可以用来揭示一个发展中的斑马鱼心脏细胞和亚细胞结构。例如，我们已经采用这种方法，心肌细胞计数总数，量化单个心肌细胞的大小，以评估增殖和凋亡，并揭示肌大会 6,12的进程。再加上独特的基因在斑马鱼的工具，目前的方法将有利于在体内模型，在此心血管生物学的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢他的帮助在斑马鱼的饲养Beninio Jomok。这项工作是由国立卫生研究院HL81753资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
