Summary
Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.
Abstract
Embrião torna-se um popular paulistinha in vivo modelo de vertebrados para estudar o desenvolvimento de doenças cardíacas e coração humano, devido à sua embriologia e genética vantajoso 1,2. Cerca de 100-200 embriões estão prontamente disponíveis a cada semana a partir de um único par de peixes adultos. Os embriões que se desenvolvem transparente utero ex torná-los ideal para avaliar defeitos cardíacos 3. A expressão de qualquer gene pode ser manipulado através de morfolino tecnologia ou injeção de RNA 4. Além disso, a frente telas genética já gerou uma lista de mutantes que afetam diferentes perspectivas de cardiogenesis 5.
Imunocoloração montar todo é uma técnica importante neste modelo animal para revelar o padrão de expressão da proteína alvo de um tecido especial 6. No entanto, imagens de alta resolução que pode revelar estruturas celulares ou subcelulares têm sido difíceis, principalmente devido à locat físicaion do coração e da pouca penetração dos anticorpos.
Aqui, apresentamos um método para solucionar esses gargalos dissecando o coração primeiro e depois conduzir o processo de coloração na superfície de uma lâmina de microscópio. Para evitar a perda de amostras pequenas e coração para facilitar o manuseio solução, restringimos a amostra coração dentro de um círculo na superfície do microscópio slides puxado por uma caneta immEdge. Após a coloração, os sinais de fluorescência pode ser diretamente observado por um microscópio composto.
Nosso novo método melhora significativamente a penetração de anticorpos, uma vez que um coração de um peixe embrionárias só consiste de camadas de células. Imagens de alta qualidade a partir de corações intactos podem ser obtidos dentro de um prazo muito reduzido para a procissão de embriões zebrafish com idades entre dia 2 a dia 6. Nosso método pode ser potencialmente estendido a outros órgãos dissecados mancha de qualquer peixe-zebra ou outros pequenos animais.
Protocol
1. Preparação de slides e câmara umidificado
- A câmara úmida pode ser feita de uma caixa, como uma caixa de ponta esvaziado. Enrole tanto a câmara ea tampa com papel alumínio para proteger as amostras da luz.
- Dentro da câmara, coloque uma pilha de toalhas de papel molhado para manter a umidade dentro da câmara, o que impedirá as amostras de coração de secagem. Definir uma microplaca pequena na parte superior da toalha de papel como um rack para os slides.
- Desenhe linhas ou círculos sobre a superfície de uma lâmina de microscópio usando a caneta immEdge para fazer poços para amostras coração com uma dimensão de 5x5 milímetros. Deixe os slides seco.
- Coloque as lâminas na câmara umidificada e adicionar 50uL formaldeído frescos 4% em cada poço.
2. Dissecção do coração embrionário
- Anestesiar o embrião de peixe em água contendo ovos E3 7 tricaina 0,4% para cerca de 1 minuto até que o peixe parar o movimento do corpo, mas ainda têm coração normalespancamento.
- Coloque uma lâmina de microscópio côncava no palco de um microscópio de dissecção. Transferência dos embriões para o bem concaved.
- Ajuste a combinação de luz do microscópio de dissecação claramente revelam o coração. Dependendo da preferência pessoal, pode ser tanto de campo escuro ou DIC-como condição de luz polarizada.
- Limpe duas seringas de insulina com etanol 75%, depois seque.
- Ajustar o microscópio de dissecação para maior ampliação e foco no coração. 'Fixar' fisicamente um embrião através da inserção de uma ponta da agulha para a fronteira gema de somito perto da cabeça. Inserir outro perto da agulha para a região do coração e puxe o coração para fora rapidamente. Se o coração não é totalmente separado do embrião, cortar o tecido remanescente conectado entre o coração ea gema.
- Ajustar o microscópio para menor ampliação e foco no coração separados. Use uma pipetteman 10μl e defini-lo ao volume 1μl. Aplicar a ponta do pipetteman a qualquer empate ou toque nacoração amostra, de modo que o coração isolado será dentro ou junto à superfície da ponta.
- Mergulhe a ponta da pipeta na solução de formaldeído 4% em lâminas preparadas e comprimir o pistão da pipeta para libertar o coração para a solução. A tensão da superfície da água também ajuda a liberar o coração da ponta da pipeta para a solução. Coloque menos de 3 corações em cada poço.
3. Imunocoloração
- Fechar a câmara e colocá-lo em uma coqueteleira com um movimento de balanço suave. Fixar a amostra do coração por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Limpe a água na parte de trás das lâminas e colocar os slides no palco de um microscópio de dissecção para a troca de tampão.
- Molhe a ponta de um pipetteman 10μl em uma região vazia em cada bem e manter a ponta na medida do possível a partir de amostras do coração. Tomar precauções para evitar o coração prender à ponta, já que os corações possam se mover com o fluxo de água quando a solução é arrastado para a ponta. Mudançaa localização da ponta, se necessário.
- Descarte a solução em um tecido e evitar a produção de todas as bolhas na ponta, pois a amostra coração é facilmente perdido na presença de bolhas de ar. Manter as amostras coração parcialmente seco por um curto período de tempo pode ajudar a manter o coração ligado ao slides.
- Adicionar 50μl PBST para cobrir a amostra coração e incubar na câmara umidificada em um movimento de balanço lento por 5 min. Repita o enxágüe mais uma vez. Após esta etapa, as amostras de coração pode ser armazenada na câmara úmida até 1 semana a 4 ° C.
- Bloco da amostra coração com soro de ovelha 10% em PBST por 1 hora em temperatura ambiente.
- Incubar a amostra coração com anticorpos primários, tais como a diluição de 1:200 β-catenina anticorpo e diluição de 1:200 mef2 anticorpo específico, em ovinos 10% de soro / PBST por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lavar a amostra coração com PBST três vezes (5 min. Cada) em temperatura ambiente.
- Incubar a amostra com secundárioanticorpos, tais como a diluição de 1:1000 Alexa marcadas anti-rato e / ou anticorpos anti-coelho, em PBST para 0,5 horas.
- Lavar as amostras coração com PBST três vezes (5 min. Cada) em temperatura ambiente.
4. Imagem
- Remover PBST e adicionar 10 mL de médio de montagem para cada poço. Rocha da câmara durante alguns minutos até que a solução se torna claro.
- Remover a maior parte do meio de montagem e cobrir todos os poços em um slide com uma tampa de vidro de microscópio (24x50).
- Coração imagem peixes usando Zeiss Axioplan 2 microscópio equipado com ApoTome (Carl Zeiss).
5. Resultados representante
Um exemplo de uma imagem que revela membrana e núcleos de todos os cardiomiócitos zebrafish é mostrado na figura. 1. anticorpos mef2c e β-catenina foram usados em conjunto para mancha amostras coração dissecados de 52 embriões zebrafish hpf. Enquanto mef2c manchas anticorpo os núcleos de cardiomiócitos, β-cateninaanticorpo revela a borda de cada célula 10/08. Ajustando o estágio do microscópio composto, as imagens das amostras do coração pode ser ajustado para a mesma orientação, o que permitirá a observação de curvatura externa e curvatura interna no coração 11. O número de cardiomiócitos total, o tamanho das células de cardiomiócitos e circularidade pode ser medido.
Outro exemplo que revela a estrutura do sarcômero de um coração embrionário é mostrado na figura. 2. Realizamos imunocoloração usando F59, um anticorpo miosina, em um coração dissecado embrionárias. A rede miofibrila em um coração inteiro embrionárias podem ser claramente revelado no menor aumento, enquanto a banda estriada de filamento grosso pode ser revelado no maior ampliação (Figura 2) 6.
Figura 1. Imunocoloração de mef2 (vermelho) e β-catenina (verde) para mostrar os núcleos e outlines de cardiomiócitos no ventrículo zebrafish. Barra de escala = 10μm
Figura 2. Immnostaining de miosina para mostrar o filamento grosso em um ventrículo zebrafish em uma ou outra baixa ampliação (A) ou alta ampliação (B). Barra de escala = 10μm
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Discussion
Em comparação com os métodos clássicos imunocoloração toda montagem, nosso método tem as seguintes vantagens. Em primeiro lugar, muito mais forte sinais fluorescentes podem ser obtidos de forma consistente, devido à penetração melhorada. Em todo o método de montagem de positividade, o tecido da pele densa que envolve o coração reduziu significativamente a penetração de muitos anticorpos, resultando em elevado ruído de fundo em todo o corpo. Este problema é especialmente grave para os embriões com mais de 3 dias pós-fertilização (DPF). Em contraste, os corações dissecados consistir apenas de algumas camadas de células, tornando a penetração muito melhor. Em segundo lugar, por causa da penetração muito melhor, todo o processo de imunocoloração pode ser reduzida de um dia em apenas algumas horas diversas. Temos bons resultados na redução do tempo de incubação de 1 hora a 30 minutos para alguns anticorpos, como actinina, Integin-linked kinase (Ilk), e β-catenina anticorpos específicos. Terceiro, imagens de alta resolução pode ser consistentemente obtidos corações intactospara revelar informações celular / subcelulares. Devido à localização do coração no interior do saco pericárdico, que fica ao lado da gema, as lentes objetivo maior de ampliação não pode ser usado para embriões imagem intacta. Portanto, o coração precisa ser dissecado se as imagens de um coração intacto são necessários. Entretanto, os detergentes, tais como 100 triton-x que são usados para melhorar a penetração em todo o processo de montagem coloração enfraquecer os embriões. Como conseqüência, os corações são facilmente quebrados durante o procedimento de dissecção. Em contraste, um coração ao vivo é muito mais forte, que pode ser facilmente separados dos tecidos vizinhos. Portanto, a morfologia intacta são mais facilmente mantida através do método proposto. Apesar de dissecar um coração pequeno peixe-zebra pode aparecer um desafio, a maioria das pessoas pode facilmente realizar este procedimento depois de várias práticas.
Temos utilizado este método para manchar corações faixa etária de 2 a 6 dpf dpf. Devido à sua localização física, corações de mesmo earlier encenado embriões são difíceis de dissecar. Resta determinar se este método pode ser ajustado para larva ou corações de adultos. Vale a pena ressaltar que os danos locais para o coração pode resultar durante o processo de dissecação, que envolve força física. Esta complicação pode ser superada através da avaliação vários corações, e em seguida, selecionando imagens com resultados consistentes ea melhor morfologia mantida.
Por causa da resolução melhorou muito, este método pode ser usado para revelar estruturas celulares e subcelulares de um coração zebrafish em desenvolvimento. Por exemplo, nós já aplicou este método para contar o número total de cardiomiócitos, para quantificar o tamanho dos cardiomiócitos individual, para avaliar a proliferação e apoptose, e revelar o processo de montagem do sarcômero 6,12. Juntamente com ferramentas exclusivas genética em peixe-zebra, o actual método facilitará o estudo da biologia cardiovascular neste modelo in vivo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Beninio Jomok por sua ajuda na criação de peixe-zebra. Este trabalho é financiado pelo NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
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References
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- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
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