Summary
zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.
Abstract
Zebrafish의 배아는 심장 개발과 유리 발생학 및 유전학 1,2으로 인해 인간의 심장 질환을 공부에 대한 생체내의 척추 모델의 인기가됩니다. 약 100-200 배아는 성인 물고기 한 쌍의에서 매주 쉽게 사용할 수 있습니다. 예 utero을 개발 투명 태아는 심장 결함에게 3 평가에 이상적합니다. 어떤 유전자의 표현은 morpholino 기술 또는 RNA 사출 사를 통해 조작하실 수 있습니다. 또한, 앞으로 유전자 스크린은 이미 cardiogenesis 5 가지 관점에 영향을 미칠 돌연변이의 목록을 생성합니다.
전체 마운트 immunostaining는 특정 조직 6 타겟 단백질의 표현 패턴을 나타내기 위해이 동물 모델에서 중요한 기술입니다. 그러나, 세포 또는 subcellular 구조를 확인할 수 있습니다 고해상도 이미지는 실제 locat으로 인해 주로 어려운되었습니다마음과 항체의 가난한 들어간 이온.
여기, 우리가 먼저 마음을 해부 다음 현미경 슬라이드의 표면에 얼룩 과정을 실시하여 이러한 병목 현상을 해결하기 위해 방법을 제시한다. 작은 마음이 샘플의 손실을 방지하기 위해 및 솔루션 처리를 촉진하기 위해, 우리는 immEdge 펜으로 그려진 현미경의 표면 슬라이드에 동그라미 안에 심장 샘플을 제한. 얼룩 후, 형광 신호를 직접 복합 현미경으로 볼 수 있습니다.
배아 물고기의 마음은 몇 가지 세포 레이어로 구성되어부터 새로운 방법, 항체에 대한 침투를 상당히 향상시킵니다. 그대로 마음의 고품질 이미지는 일 2 일 6 세 zebrafish 배아에 대해 훨씬 감소 행렬 시간 내에 얻을 수 있습니다. 우리의 방법은 잠재적으로 zebrafish이나 다른 작은 동물 중 하나에서 해부하는 다른 장기를 얼룩이 확장될 수 있습니다.
Protocol
1. 슬라이드의 준비 및 humidified 챔버
- humidified 챔버는 비운 팁 박스 같은 상자에서 만들 수 있습니다. 챔버와 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버를 모두 넣어.
- 챔버 내부, 건조에서 심장 샘플을 방지할 수 있습니다 챔버 내의 습도를 유지하기 위해 젖은 종이 수건 더미를 넣어. 슬라이드에 선반으로 종이 타월 위에 작은 microplate를 설정합니다.
- 5x5 mm에 대한 차원과 심장 샘플 우물을 할 수있는 immEdge의 펜을 사용하여 현미경 슬라이드의 표면에 선 또는 원을 중 하나를 그립니다. 슬라이드가 건조하자.
- humidified 챔버에 슬라이드를 넣고 각 우물에 50ul 신선한 4 % 포름 알데히드를 추가합니다.
2. 배아 심장의 해부
- 생선 정지 몸 움직임까지 약 1 분 0.4 % tricaine을 포함 E3 계란 물 7 물고기의 배아를 마취 그래도 정상적인 마음을 가지고구타.
- 해부 현미경의 무대에 오목 현미경 덮개를 씌우고. concaved 잘 수있는 배아를 전송합니다.
- 명확하게 마음을 나타내기 위해 해부 현미경의 빛을 조합을 조정합니다. 개인 선호에 따라, 그것은 어두운 필드 또는 DIC과 같은 편광 상태 중 수 있습니다.
- 다음 건조, 75 % 에탄올 두 개의 인슐린 주사기를 청소합니다.
- 심장에 더 높은 배율과 집중 해부 현미경을 조정하십시오. 실제로 머리에 가까운 노른자 - 체절 경계 하나의 바늘 끝부분을 삽입하여 배아를 해결할 수 있습니다. 심장 지역에 다른 바늘 가까이를 삽입하고 신속하게 심장을 가져옵니다. 심장이 완전히 배아로부터 분리되지 않을 경우 심장과 노른자 사이에 남아있는 연결 조직을 잘라.
- 분리된 심장에 낮은 배율과 초점 현미경을 조정합니다. 10μl pipetteman을 사용하여 1μl 볼륨으로 설정합니다. 중 그리거나 만지지로 pipetteman의 팁을 적용격리된 심장 내에서 또는 팁의 표면에 부착하거나되도록 심장 샘플.
- 준비된 슬라이드에 4 % 포름 알데히드 용액에 피펫 팁을 찍어 및 솔루션에 마음을 공개하는 피펫 피스톤을 놓으면 되죠. 물 표면의 장력은 또한 피펫 팁에서 솔루션 마음을 출시하는 데 도움이됩니다. 각 잘 3 마음보다 놔.
3. Immunostaining
- 챔버를 닫고 부드러운 출렁 이는 운동과 함께 흔드는에 넣어. 상온에서 20 분 심장 샘플을 수정.
- 슬라이드의 뒷면에있는 물을 닦아 및 교환 버퍼에 대한 해부 현미경의 무대에 슬라이드를 넣어.
- 각 우물에 빈 영역에 10μl pipetteman에서 팁을 딥과 심장 표본에서 최대한 팁을 유지. 솔루션 끝에 그려진 때 마음은 물 흐름과 함께 이동 수도 있기 때문에, 팁에 연결 마음을 피하기 위해주의를 가져가라. 변화필요한 경우 팁 현지화.
- 조직에 솔루션을 폐기하고 심장 샘플 쉽게 기포의 존재에 손실이기 때문에 끝에 거품을 생산하지 마십시오. 짧은 시간 동안 심장 샘플 부분적으로 건조 유지하면 마음이 슬라이드에 부착된 계속 도움이 될 수 있습니다.
- 심장 샘플을 커버 5 분 느린 출렁 이는 운동의 humidified 챔버에서 부화 50μl PBST를 추가합니다. 한 번 더 씻어 반복합니다. 이 단계 후, 심장 샘플 4 humidified 챔버 최대 일주 ° C.에 저장될 수 있습니다
- 상온에서 1 시간 PBST에서 10 % 양의 혈청과 심장 샘플을 차단합니다.
- 이러한 β - catenin 항체의 1:200 희석 및 mef2 특정 항체의 1:200 희석과 같은 기본 항체와 심장 샘플을 품어, 10 % 양의 실온에서 1 시간 동안 혈청 / PBST.
- 상온에서 PBST 세 번 (5 분. 각)과 심장 샘플을 씻으십시오.
- 보조로 샘플을 품어PBST에서 0.5 시간 동안 이러한 알렉사 - 태그 안티 - 마우스 및 / 또는 방지 토끼 항체의 1:1000 희석으로 항체,.
- PBST로 세 번 심장 샘플을 씻으 (5 분. 각) 실온에서합니다.
4. 이미징
- PBST를 제거하고 각 잘 ~ 10 μl 장착 매체를 추가합니다. 솔루션은 분명해진다 때까지 몇 분 동안 곳에는 바위.
- 장착 매체의 대부분을 제거하고 현미경 커버 유리 (24x50) 한 슬라이드에있는 우물을 모두 커버.
- 자이스 혈구 Axioplan이 현미경을 사용하여 이미지 물고기 마음이 ApoTome (칼 자이스 혈구)를 갖추고 있습니다.
5. 대표 결과
모든 zebrafish의 cardiomyocytes의 막과 핵을 드러 이미지의 예제는 그림에 표시됩니다. 1. mef2c 및 β - catenin 항체는 52 hpf의 zebrafish 배아에서 심장 해부 샘플을 얼룩 함께 사용되었습니다. 동안 mef2c 항체 얼룩 cardiomyocytes의 핵, β - catenin항체는 각 세포 8-10의 경계를 나타낸다. 복합 현미경의 무대를 조절함으로써, 심장 샘플 이미지는 외부 곡률과 마음 11 내부 곡률 관찰 수 같은 방향으로 조정할 수 있습니다. 총 cardiomyocyte 번호, cardiomyocyte 세포 크기, 순환성 그때 측정할 수 있습니다.
배아 심장의 구조를 보여줍니다 sarcomeric 또 다른 예제는 그림에 표시됩니다. 2. 우리는 해부 배아 마음에 F59, 마이 오신의 항체를 사용 immunostaining 수행했습니다. 두꺼운 필라멘트의 줄무늬 밴드가 높은 배율 (그림 2) 6 계시 수 있지만 전체 배아 중심에 myofibril 네트워크는 명확하게, 낮은 배율에서 발표하실 수 있습니다.
그림 1. 핵과 나와!를 표시 mef2 (적색)과 β - catenin (녹색)의 Immunostainingzebrafish의 뇌실에서 cardiomyocytes의 아이 네스. 스케일 바 = 10μm
그림 2.하거나 낮은 배율 (A) 또는 높은 배율 (B)에 zebrafish 뇌실에서 두꺼운 필라멘트를 보여 마이 오신의 Immnostaining. 규모 막대 = 10μm
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Discussion
고전 온 마운트 immunostaining 방법에 비해, 우리의 방법은 다음과 같은 장점이있다. 첫째, 훨씬 강한 형광 신호를 지속적으로 개선 침투력으로 인해 얻을 수 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 방법에서 마음을 둘러싼 치밀한 피부 조직이 상당히 전신 높은 배경의 결과로, 많은 항체의 침투를 감소. 이 문제는 3 일 후 수정 (dpf)보다 오래된 배아에 특히 심각합니다. 반대로, 해부하는 마음은 훨씬 더 침투력을 렌더링, 몇 셀 레이어로 구성되어 있습니다. 둘째, 때문에 많은 개선 침투의 immunostaining의 전 과정은 일일에서 불과 몇 시간 줄일 수 있습니다. 우리는 성공적으로 일시간에서 같은 Actinin, Integin 링크된 키나제 (Ilk) 및 β - catenin 특정 항체 같은 항체 30 분 배양 시간을 단축했습니다. 셋째, 고해상도 이미지는 일관되게 그대로 마음에서 얻을 수 있습니다세포 / subcellular 정보를 공개합니다. 때문에 노른자 옆에있는 pericardiac SAC 안에있는 마음의 로컬 리 제이션의 높은 배율 객관적인 렌즈는 이미지가 그대로 태아하는 데 사용할 수 없습니다. 따라서 심장이 손상 심장의 이미지가 필요한 경우를 해부해야합니다. 그러나 이러한 배아를 약화 전체 마운트 얼룩 절차의 침투를 개선하는 데 사용됩니다 트리톤 - X - 100과 같은 세제. 그 결과, 마음은 쉽게 해부 절차 중에 깨진 수 있습니다. 반대로, 실제 마음은 쉽게 그 주변 조직에서 분리 수있는, 훨씬 강력합니다. 따라서, 손상 형태는보다 쉽게 제안된 방법을 사용하여 유지하고 있습니다. 작은 zebrafish의 심장을 해부하는 것은 어려운 나타날 수도 있지만, 대부분의 사람들은 쉽게 여러 사례를 후에이 절차를 수행할 수 있습니다.
우리는이 dpf에서 6 dpf하는 노인의 마음을 얼룩이 방법을 이용했습니다. 의 실제 위치, 심지어 얼에서 마음 때문에ier은 배아는 해부하다하기 어렵기 개최. 그것은이 방법이 유충 또는 성인의 마음에 대해 조정할 수 있는지 여부를 결정 남아 있습니다. 그것은 심장에 지방 손상이 물리적 폭력을 포함 해부 과정 동안 결과 수도 지적 가치가있다. 이 합병증은 여러 가지 마음을 평가하고 일관성있는 결과와 최상의 유지 형태와 이미지를 선택하여 극복할 수 있습니다.
때문에 훨씬 향상된 해상도,이 방법은 개발 zebrafish의 마음 휴대폰과 subcellular 구조를 모두 공개하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 이미 확산과 apoptosis을 평가하기 위해, 개별 cardiomyocyte 크기를 계량하기 위해 cardiomyocytes의 총 수를 계산하고, 6,12 sarcomere 조립의 과정을 나타내기 위해이 방법을 적용했습니다. 함께 zebrafish의 독특한 유전자 도구, 현재 방법은 생체내 모델이 심장 혈관 생물학의 연구를 용이하게합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 zebrafish 축산 그의 도움 Beninio Jomok 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH HL81753으로 후원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
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