Summary
Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.
Abstract
Zebrafisch-Embryo wird zu einem beliebten In-vivo-Modell zum Studium der Wirbeltiere kardiale Entwicklung und menschlichen Herzerkrankungen aufgrund seiner vorteilhaften Embryologie und Genetik 1,2. Etwa 100-200 Embryonen sind leicht zugänglich jede Woche von einem einzigen Paar von erwachsenen Fischen. Die transparente Embryonen, die ex utero entwickeln eignen sie sich ideal für die Beurteilung der Herzfehler 3. Der Ausdruck eines beliebigen Gens kann über Morpholino Technologie-oder RNA-Injektion 4 manipuliert werden. Darüber hinaus freuen genetische Screens haben bereits eine Liste von Mutanten, die unterschiedlichen Perspektiven der Kardiogenese 5 berühren generiert.
Whole mount Immunfärbung ist eine wichtige Technik in diesem Tiermodell die Expressionsmuster des Zielproteins zu einem bestimmten Gewebe 6 offenbaren. Allerdings haben Bilder mit hoher Auflösung, dass zelluläre oder subzelluläre Strukturen offenbaren kann schwierig gewesen, vor allem aufgrund der physikalischen location des Herzens und der schlechten Penetration der Antikörper.
Hier stellen wir eine Methode, um diese Engpässe durch Sezieren Herz zuerst und dann die Durchführung der Färbung auf der Oberfläche eines Objektträgers Adresse. Um den Verlust von kleinen Herzen Proben zu verhindern und die Lösung Handhabung zu erleichtern, haben wir eingeschränkt Herzen Proben innerhalb eines Kreises auf der Oberfläche der Objektträger durch eine immEdge Stift gezeichnet. Nach der Färbung kann die Fluoreszenz-Signale direkt von einem zusammengesetzten Mikroskop beobachtet werden.
Unsere neue Methode verbessert das Eindringen von Antikörpern, da ein Herz aus einem embryonalen Fisch besteht nur aus wenigen Zellschichten. Qualitativ hochwertige Bilder von intakten Herzen kann innerhalb eines stark reduzierten Prozession Zeit für Zebrafischembryonen im Alter von Tag 2 bis Tag 6 gewonnen werden. Unsere Methode kann möglicherweise ausgeweitet werden auf andere Organe entweder von Zebrafisch oder andere kleine Tiere seziert Fleck.
Protocol
1. Vorbereitung von Dias und Feuchtekammer
- Die befeuchteten Kammer kann aus einer Kiste wie ein geleert tip box erfolgen. Wrap sowohl der Kammer und der mit Alufolie abdecken, um die Proben vor Licht zu schützen.
- Im Inneren der Kammer, legte einen Haufen nasse Papiertücher, um die Feuchtigkeit in der Kammer, die das Herz Proben vor dem Austrocknen wird verhindert, aufrecht zu erhalten. Setzen Sie einen kleinen Microplatte auf der Oberseite des Papiertuch als Ablage für die Folien.
- Zeichnen Sie Linien oder Kreise auf der Oberfläche eines Objektträgers mit dem immEdge Stift Brunnen für Herz-Proben mit einer Größe ca. 5x5 mm zu machen. Lassen Sie die Folien trocken.
- Legen Sie die Folien in der feuchten Kammer und fügen 50ul frisch 4% Formaldehyd in jede Vertiefung.
2. Dissection von embryonalen Herzen
- Anesthetize sich der Embryo in E3 Ei Wasser 7 mit 0,4% Tricaine für ca. 1 Minute bis der Fisch zu stoppen Bewegung des Körpers, aber immer noch normales Herzzu schlagen.
- Legen Sie eine konkave Objektträger auf der Bühne eines Dissektionsmikroskop. Übertragen Sie die Embryonen in die konkave gut.
- Passen Sie das Licht Kombination der Präpariermikroskop zu zeigen deutlich das Herz. Je nach persönlicher Vorliebe, könnte es entweder Dunkelfeld oder DIC-like polarisiertem Licht Zustand sein.
- Saubere zwei Insulin-Spritzen mit 75% Ethanol, dann trocknen lassen.
- Passen Sie die Dissektionsmikroskop höhere Vergrößerung und Fokussierung auf das Herz. Körperlich fix ein Embryo durch Einstecken mit einem Nadelspitze in den Dotter-Somiten Grenze in der Nähe des Kopfes. Legen Sie eine andere Nadel in der Nähe der Herzgegend und ziehen das Herz schnell. Wenn das Herz nicht völlig aus dem Embryo getrennt, schneiden Sie die restlichen angeschlossenen Gewebe zwischen dem Herzen und dem Eigelb.
- Passen Sie das Mikroskop geringer Vergrößerung und Fokussierung auf die getrennte Herzen. Verwenden Sie eine 10 &mgr; l pipetteman und setzen Sie ihn auf 1μl Volumen. Übernehmen Sie die Spitze des pipetteman entweder ziehen oder berühren Sie dieHerz Probe, so dass das isolierte Herz wird entweder innerhalb oder an der Oberfläche der Spitze sein.
- Tauchen Sie die Pipettenspitze in 4% Formaldehyd-Lösung auf vorbereitete Objektträger und drücken Sie die Pipette Kolben an das Herz in die Lösung veröffentlichen. Die Spannung der Wasseroberfläche hilft auch das Herz von Pipettenspitze, um die Lösung veröffentlichen. Legen Sie weniger als 3 Herzen in jede Vertiefung.
3. Immunfärbung
- Schließen Sie die Kammer und legte es auf einem Schüttler mit einer sanften Schaukelbewegung. Fix Herzen Probe für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Wischen Sie das Wasser auf der Rückseite der Folien und legen die Folien auf der Bühne eines Dissektionsmikroskop für Puffer auszutauschen.
- Tauchen Sie die Spitze von einem 10 &mgr; l pipetteman in einen leeren Bereich in jede Vertiefung und halten Sie die Spitze so weit wie möglich von Herz-Proben. Nehmen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um das Herz Befestigung an der Spitze zu vermeiden, da Herzen mit dem Wasserstrom zu bewegen könnte, wenn die Lösung in die Spitze gezogen wird. Änderungdie Spitze Lokalisierung, falls nötig.
- Entsorgen Sie die Lösung auf ein Gewebe und vermeiden jegliche Blasen in die Spitze, da das Herz Probe wird leicht in Gegenwart von Luftblasen verloren. Keeping das Herz Proben teilweise trocken für eine kurze Zeit kann helfen, die Herzen zu bleiben an den Folien.
- Add 50 ul PBST das Herz Probe abdecken und inkubieren in der feuchten Kammer in eine langsame Schaukelbewegung für 5 min. Wiederholen Sie die Spülung noch einmal. Nach diesem Schritt kann das Herz Proben in der feuchten Kammer bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden
- Blockieren Sie die Herzen Probe mit 10% Schafserum in PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Herzen Probe mit primärer Antikörper, wie zB 1:200 Verdünnung von β-Catenin-Antikörper und 1:200 Verdünnung MEF2 spezifischen Antikörper, in 10% Schafserum / PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Herzen Probe mit PBST dreimal (5 min.) Bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Probe mit sekundärenAntikörper, wie 1:1000 Verdünnung von Alexa-markierten anti-Maus und / oder anti-Kaninchen-Antikörper, in PBST 0,5 Stunden.
- Waschen Sie die Herzen Proben mit PBST dreimal (5 min.) Bei Raumtemperatur.
4. Imaging
- Entfernen PBST und mit 10 ul Eindeckmedium in jede Vertiefung. Rock the Kammer für einige Minuten, bis die Lösung klar wird.
- Entfernen Sie die meisten der Eindeckmedium und decken alle der Brunnen in eine Folie mit einem Mikroskop Deckglas (24x50).
- Bild Fisch Herz mit Zeiss Axioplan 2 Mikroskop mit ApoTome (Carl Zeiss) ausgestattet.
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für ein Bild, das Membran und Kerne aller Zebrafisch Kardiomyozyten offenbart, ist in Abb. dargestellt. 1. mef2c und β-Catenin-Antikörper wurden zusammen, um Herz-Proben von 52 hpf Zebrafischembryo seziert Flecken verwendet. Während mef2c Antikörper färbt die Kerne von Herzmuskelzellen, β-CateninAntikörper zeigt die Grenze der einzelnen Zellen 8-10. Durch die Anpassung der Phase des zusammengesetzten Mikroskop können die Bilder des Herzens Proben der gleichen Orientierung, die die Beobachtung der äußeren Krümmung und der inneren Krümmung im Herzen 11 ermöglichen wird eingestellt werden. Die gesamte Anzahl Kardiomyozyten, Kardiomyozyten Zellgröße und Zirkularität kann dann gemessen werden.
Ein weiteres Beispiel, das Sarkomer Struktur eines embryonalen Herzens offenbart, ist in Abb. dargestellt. 2. Wir führten Immunfärbung mit F59, ein Myosin-Antikörper, in einem aufgeschnittenen embryonalen Herzen. Die Myofibrillen Netzwerk in eine ganze embryonale Herz kann deutlich niedrigeren Vergrößerung offenbart werden, während die gestreiften Band aus dickem Faden bei höherer Vergrößerung (Abb. 2) 6 enthüllt werden kann.
Abbildung 1. Immunfärbung von MEF2 (rot) und β-Catenin (grün), die Kerne und outl zeigenines der Kardiomyozyten in einem Zebrafisch Ventrikels. Balken = 10 um
Abbildung 2. Immnostaining von Myosin der dicken Filamente in einem Zebrafisch Ventrikel entweder geringer Vergrößerung (A) oder mit hoher Vergrößerung (B) zu zeigen. Balken = 10 um
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Discussion
Im Vergleich zu klassischen whole mount Immunfärbung Methoden, hat unsere Methode folgende Vorteile. Erstens kann viel stärkere Fluoreszenzsignale konsequent erreicht werden durch die verbesserte Penetration. In der ganze Berg Immunfärbung Methode, die dichten Haut umgebende Gewebe des Herzens deutlich reduziert das Eindringen von vielen Antikörper, was zu hohen Hintergrund in den ganzen Körper. Dieses Problem ist besonders gravierend für Embryonen älter als 3-Tages-post-Fertilisation (DPF). Im Gegensatz dazu seziert Herzen bestehen nur aus wenigen Zellschichten, Rendering viel bessere Penetration. Zweitens, weil der deutlich verbesserten Penetration, kann der gesamte Prozess der Immunfärbung von 1 Tag bis nur einige Stunden reduziert werden. Wir haben erfolgreich die Inkubationszeit von 1 Stunde bis 30 Minuten für einige Antikörper wie Actinin, Integin-linked kinase (ILK) und β-Catenin-spezifischen Antikörpern reduziert. Drittens Bilder mit hoher Auflösung kann konsequent aus intakten Herzen gewonnen werdenzu zellulären / subzellulären Informationen preisgeben. Aufgrund der Lokalisation des Herzens innerhalb des pericardiac Sack, der neben dem Dotter ist, können höhere Vergrößerung Objektive nicht zum Bild intakten Embryonen verwendet werden. Daher wird die Herzen müssen seziert, wenn Bilder von einer intakten Herzen benötigt werden. Allerdings Detergenzien wie Triton-X-100, die verwendet werden, um das Eindringen in die ganze Berg Färbung zu verbessern schwächen die Embryonen. Als Folge sind Herz leicht während der Präparation Verfahren gebrochen. Im Gegensatz dazu ist ein lebendiges Herz viel stärker, die sich leicht aus den benachbarten Geweben getrennt werden. Daher sind intakt Morphologie leichter gepflegt mit dem vorgeschlagenen Verfahren. Obwohl das Sezieren einer kleinen Zebrafisch Herzen erscheinen mag schwierig, die meisten Leute einfach dieses Verfahren auch nach mehreren Methoden.
Wir haben diese Methode genutzt, um die Herzen im Alter von 2 bis 6 dpf dpf Fleck. Aufgrund seiner physischen Standort, Herzen aus, auch Grafier inszeniert Embryonen sind schwer zu sezieren. Es bleibt zu prüfen, ob diese Methode für Larve oder Erwachsener Herzen angepasst werden kann. Es lohnt sich, darauf hinzuweisen, dass lokale Schädigungen des Herzens können sich während der Dissektion Prozess, der körperliche Gewalt beinhaltet führen. Diese Komplikation kann durch die Bewertung mehrere Herzen, und dann Auswahl von Bildern mit konsistenten Ergebnissen und den besten gepflegt Morphologie überwunden werden.
Aufgrund der deutlich verbesserten Auflösung, kann diese Methode verwendet, um sowohl zellulären und subzellulären Strukturen eines Entwicklungslandes Zebrafisch Herzen zu enthüllen. Zum Beispiel haben wir bereits diese Methode angewendet, um Gesamtzahl der Kardiomyozyten zu zählen, die einzelnen Kardiomyozyten Größe zu quantifizieren, um die Proliferation und Apoptose zu bewerten und den Prozess der Sarkomer Montage 6,12 offenbaren. Zusammen mit einzigartigen genetischen Werkzeuge in Zebrafisch, wird das vorliegende Verfahren die Untersuchung von Herz-Kreislauf-Biologie in dieser Erleichterung in vivo-Modell.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Beninio Jomok für seine Hilfe beim Zebrafisch Tierhaltung. Diese Arbeit wird durch NIH HL81753 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
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