Summary
Ett snabbt sätt att göra immunfärgning av zebrafisk embryonala hjärta beskrivs. Jämfört med hela montera immunfärgning strategi, ökar denna metod dramatiskt penetrering av antikroppar, som gör det möjligt att få bilder med hög upplösning som visar cellulära / subcellulära strukturer i hjärtat inom en mycket reducerad handläggningstiden.
Abstract
Zebrafisk embryo blir ett populärt in vivo ryggradsdjur modell för att studera hjärtats utveckling och mänskliga hjärtsjukdomar på grund av sitt fördelaktiga embryologi och genetik 1,2. Om 100-200 embryon finns tillgängliga varje vecka från ett enda par av vuxen fisk. Den transparenta embryon som utvecklar ex utero gör dem idealiska för att bedöma hjärtfel 3. Uttrycket av en gen kan manipuleras via morpholino teknik eller RNA injektion 4. Dessutom framåt genetiska skärmar har redan genererat en lista med mutanter som påverkar olika perspektiv på cardiogenesis 5.
Hela montera immunfärgning är en viktig teknik i denna djurmodell för att avslöja uttrycket mönstret av de riktade protein för att en viss vävnad 6. Dock har högupplösta bilder som kan avslöja cellulär eller subcellulära strukturer varit svårt, främst på grund av den fysiska lokaliion av hjärtat och de fattiga penetrationen av antikroppar.
Här presenterar vi en metod för att hantera dessa flaskhalsar genom att dissekera hjärta först och sedan genomför färgning processen på ytan av ett objektglas. För att förhindra förlust av små hjärtan prover och för att underlätta lösning hantering, vi begränsat hjärtat prov inom en cirkel på ytan av objektglas teckningar av en immEdge penna. Efter färgning kan fluorescens signaler observeras direkt av ett sammansatt mikroskop.
Vår nya metod förbättrar avsevärt penetration för antikroppar, eftersom ett hjärta från en embryonal fisk bara består av ett fåtal cellager. Bilder med hög kvalitet från intakta hjärtan kan erhållas inom en mycket reducerad procession tid för zebrafisk gamla embryon från dag 2 till dag 6. Vår metod kan eventuellt utvidgas till att färga andra organ dissekeras från antingen zebrafisk eller andra smådjur.
Protocol
1. Beredning av diabilder och fuktig kammare
- Den fuktig kammare kan göras från en låda som en tömd tips låda. Linda både kammaren och täck med aluminiumfolie för att skydda proverna från ljus.
- Inne i kammaren, sätta en hög med våta pappershanddukar för att hålla fuktigheten i kammaren, vilket kommer att förhindra att hjärtat prover från att torka. Ställ en liten mikroplattor ovanpå pappershandduk som ett rack för bilderna.
- Rita antingen linjer eller cirklar på ytan av ett objektsglas med immEdge penna för att göra brunnar för hjärt-prover med en dimension ca 5x5 mm. Låt objektglasen torka.
- Placera bilderna i fuktad kammare och lägga 50ul färska 4% formaldehyd i varje brunn.
2. Dissekering av embryonala hjärta
- Bedöva fisken embryot i E3 ägg vatten 7 innehåller 0,4% tricaine i ca 1 minut tills fisken sluta kroppsrörelser, men fortfarande har normalt hjärtaslå.
- Sätt en konkav objektsglas på scenen av en dissektion mikroskop. Överför embryon till concaved väl.
- Justera ljus kombination av dissekera mikroskop för att tydligt visa hjärtat. Beroende på personliga preferenser, kan det vara antingen mörka fältet eller DIC-liknande polariserat ljus skick.
- Rengör två insulinsprutor med 75% etanol, sedan torr.
- Justera dissekering mikroskop för att högre förstoring och fokusera på hjärtat. Fysiskt fixa ett embryo genom att sticka in en nål spetsen i äggulan-somit gränsen nära huvudet. Sätt in en annan nål nära hjärtat regionen och dra ut hjärtat ur snabbt. Om hjärtat inte är helt skild från embryot, skär av de resterande anslutna vävnaden mellan hjärtat och äggula.
- Justera mikroskopet till lägre förstoring och fokusera på de separerade hjärtat. Använd en 10μl pipetteman och sätt det till 1μl volym. Applicera toppen av pipetteman att antingen rita eller röra vidhjärta prov, så att den isolerade hjärta kommer att vara antingen inom eller knutna till ytan av spetsen.
- Doppa pipettspetsen i 4% formaldehyd lösning på förberedda bilder och tryck på pipetten kolven att släppa hjärtat i lösningen. Spänningen på vattenytan bidrar också till att frigöra hjärtat från pipettspetsen till lösningen. Sätt mindre än 3 hjärtan i varje brunn.
3. Immunfärgning
- Stäng kammaren och satte den på en shaker med en lätt gungande rörelse. Fäst hjärtat provet i 20 minuter i rumstemperatur.
- Torka av vattnet på baksidan av bilderna och sätta diabilder på scenen av en dissektion mikroskop för buffert utbyte.
- Doppa spetsen av en 10μl pipetteman i en tom region i varje brunn och hålla spetsen så långt som möjligt från hjärtat prover. Ta varnar för att undvika att hjärtat är knutna till toppen, eftersom hjärtan kan röra sig med vattenflödet när lösningen dras in i spetsen. Ändraspetsen lokalisering, om det behövs.
- Kassera lösningen på en vävnad och undvika att ge några bubblor i spetsen sedan hjärtat provet lätt vilse i närvaro av luftbubblor. Att hålla hjärtat prover delvis torrt för en kort tid kan hjälpa hjärtan vara kopplad till bilderna.
- Lägg 50μl PBST att täcka hjärtat provet och inkubera i fuktig kammare i en långsam gungande rörelse i 5 min. Upprepa skölj en gång till. Efter detta steg kan hjärtat proverna förvaras i fuktig kammare upp till 1 vecka vid 4 ° C.
- Blockera hjärtat prov med 10% får serum i PBST i 1 timme i rumstemperatur.
- Inkubera hjärtat provet med primära antikroppar, såsom 1:200 utspädning av β-catenin antikropp och 1:200 utspädning av mef2 specifik antikropp, i 10% får serum / PBST i 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta hjärtat provet med PBST tre gånger (5 min. Vardera) vid rumstemperatur.
- Inkubera provet med sekundärantikroppar, såsom 1:1000 utspädning av Alexa-märkta anti-mus och / eller anti-kanin-antikroppar, i PBST för 0,5 timme.
- Tvätta hjärtat prover med PBST tre gånger (5 min. Vardera) vid rumstemperatur.
4. Imaging
- Ta bort PBST och tillsätt 10 l monteringsmedium till varje brunn. Rock kammaren i flera minuter tills lösningen blir klar.
- Ta bort de flesta av de monteringsmedium och täcka alla av brunnarna i en bild med ett mikroskop skyddsglas (24x50).
- Bild fisk hjärta med Zeiss Axioplan 2 mikroskop utrustat med ApoTome (Carl Zeiss).
5. Representativa resultat
Ett exempel på en bild som avslöjar membran och kärnor av alla zebrafisk cardiomyocytes visas i figur. 1. mef2c och β-catenin antikroppar används tillsammans för att färga mitt prover skäras ut från 52 HPF zebrafisk embryo. Medan mef2c antikropp fläckar kärnan i cardiomyocytes, β-cateninantikroppar visar gränsen mellan varje cell 8-10. Genom att justera steget i det sammansatta mikroskopet, kan bilder av hjärtat prover anpassas till samma orientering, som kommer att möjliggöra observation av yttre krökning och inre krökning i hjärtat 11. Det totala cardiomyocyte nummer, cardiomyocyte cell storlek och rörlighet i båda riktningarna kan sedan mätas.
Ett annat exempel som visar sarcomeric strukturen i en embryonal hjärta visas i figur. 2. Vi gjorde immunfärgning med F59, en myosin antikropp, i en dissekeras embryonala hjärta. Den myofibrill nätverk i hela embryonal hjärta klart kan avslöjas vid lägre förstoring, medan den tvärstrimmiga band tjocka filament kan avslöjas vid högre förstoring (Fig. 2) 6.
Figur 1. Immunfärgning av mef2 (röd) och β-catenin (grön) för att visa atomkärnor och outlines av cardiomyocytes i en zebrafisk kammare. Skala bar = 10μm
Figur 2. Immnostaining av myosin att visa den tjocka glödtråden i en zebrafisk kammare på antingen låg förstoring (A) eller hög förstoring (B). Skalningsfält = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med klassiska hela montera immunfärgning metoder har vår metod följande fördelar. Första kan mycket starkare fluorescerande signaler konsekventa resultat tack vare förbättrad penetration. I hela berget immunfärgning metoden minskas den täta hud vävnad som omger hjärtat avsevärt penetration av många antikroppar, vilket resulterar i hög bakgrund i hela kroppen. Detta problem är särskilt allvarliga för embryon äldre än tre dagar efter befruktning (DPF). Däremot dissekerade hjärtan består av endast ett fåtal cellager, som gör mycket bättre penetration. För det andra, på grund av det mycket bättre penetration, kan hela processen med immunfärgning minskas från 1 dag till bara några timmar. Vi har framgångsrikt minskat inkubationstiden från 1 timme till 30 minuter för vissa antikroppar som Actinin, Integin-linked kinase (sort) och β-catenin specifika antikroppar. Tredje, högupplösta bilder konsekvent kan erhållas från intakta hjärtanatt avslöja cellulär / subcellulära information. På grund av lokaliseringen av hjärtat inne i perikardiell säck som ligger i anslutning till äggulan, kan högre förstoring objektiv inte användas för att bilden intakt embryon. Därför kommer hjärtat att behöva dissekerade om bilder av en intakt hjärta behövs. Men rengöringsmedel som Triton-X-100 som används för att förbättra penetrationen i hela berget färgningsproceduren försvaga embryon. Som en konsekvens är hjärtan lätt bryts under dissekering förfarandet. Däremot är ett levande hjärta mycket starkare, som lätt kan separeras från dess angränsande vävnader. Därför är intakta morfologi mer lättskött med hjälp av den föreslagna metoden. Trots att dissekera en liten zebrafisk hjärta kan förefalla utmanande, de flesta människor kan göra enkelt denna procedur efter flera metoder.
Vi har använt denna metod för att färga hjärtan i åldern 2 DPF till 6 DPF. På grund av dess fysiska plats, hjärtan från och med earlIER iscensatt embryon är svåra att dissekera. Det återstår att avgöra om denna metod kan justeras för larv eller hjärtan vuxen. Det är värt att påpeka att lokala skador på hjärta kan uppstå under dissektionen processen, som innebär fysiskt våld. Denna komplikation kan övervinnas genom att utvärdera flera hjärtan, och sedan välja bilder med konsekventa resultat och bäst bevarade morfologi.
På grund av mycket bättre upplösning, kan denna metod användas för att avslöja både cellulära och subcellulära strukturer i ett utvecklingsland zebrafisk hjärta. Till exempel har vi redan tillämpat denna metod för att räkna antalet cardiomyocytes, att kvantifiera enskilda cardiomyocyte storlek, för att bedöma spridning och apoptos, och att avslöja processen sarcomere montering 6,12. Tillsammans med unika genetiska verktyg i zebrafisk, kommer den nuvarande metoden underlätta studier av hjärt-biologi i in vivo-modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Beninio Jomok för hans hjälp i zebrafisk djurhållning. Detta arbete finansieras av NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
