Summary
血液脳関門（BBB）のマイクロバブル媒介集束超音波の乱れは、脳の非侵襲的な標的薬物送達のための有望な技術です。
Abstract
血液脳関門（BBB）の集束超音波（FUS）の中断は、BBB 1-5を回避するためのますます調査手法である。それは小さいサイズ6で約500 Daより分子に脳組織に血管系からの分子の通過を制限するようにBBBは、脳疾患の医薬治療への重要な障害である。 FUS誘導BBBの中断（BBBD）は一時的かつ可逆的4であり、高度にローカライズされていることBBBD誘導の化学的手段利点があります。 FUS誘導BBBDそれ以外の場合は十分な濃度の組織への成果物ではありません脳、上の治療薬の広い範囲の影響を調査するための手段を提供します。超音波パラメータの広い範囲がBBB 2,5,7中断することで成功を収めているが、正確なターゲティングに成功した混乱を確保するための実験手順で、いくつかの重要なステップがあります。この機能実装オールアウトラインはどのように重要な動物の準備と実験のマイクロバブル処理の手順に焦点を当てて、ラットモデルでBBBD誘導されるMRIガイド下FUSを実現しています。
Protocol
1。超音波やMRIのセットアップ
MRI互換性のある3軸集束超音波システム（FUS·インスツルメンツ社、トロント、オンタリオ、カナダ）本研究で使用されています。二つの異なる超音波トランスデューサが使用されています。統合されたとの社内構築551.5 kHzの球状に集束されたトランスデューサーは（曲率半径= 60ミリメートル、外径= 75ミリメートル、内径= 20 mm）、および1.503 MHzで、8セクタの配列単一の要素球状に焦点を当てたトランスデューサー（= 0.8、絞り値= 10センチFN）として駆動PZTハイドロホン（Imasonic株式会社VorayシュルL'Orgnon、フランス）。 MRI互換性PVDF受信機8は、551.5 kHzの振動子を用いた場合アコースティックエミッションを記録するために使用されていました。別の機器が使用されている場合は、次のことが示唆されています。
- 範囲0.25 MHzの-1.5 MHzの中心周波数と1以下のfナンバー（曲/開口部の半径）と適切なキャリブレーション超音波トランスデューサを選択します。
- 水浴FIを配置1.5 Tまたは3 T MRIのベッドの上で暖かく、脱気、脱イオン水でlled。水浴は、動物を保持することができ、トッププレートを持っている必要があります。水面に面しており、MRI互換性のある3軸位置決めステージやシステムの9日にタンク内の超音波トランスデューサをマウントします。
- 浸透パネルを介して超音波駆動装置に変換器ケーブルを実行します。
- ファンクション·ジェネレータとパワーアンプを使用してトランスデューサの駆動信号を生成します。反映され電力を最小限に抑えるために、外部整合回路を使用しています。
- トランスデューサの焦点距離を知って、水面でのトランスデューサの焦点を置き、目に見える噴水を生成するために水の表面を超音波処理してください。ステップ1.6および1.7は、生成された噴水を使用してフォーカスを登録する方法について説明します。結果として温度上昇は、MRIで焦点に熱吸収ゲルとイメージングを超音波処理が含まれ、フォーカスを検索するためのより正確な方法は、9に記載されています</>のsup。
- MR画像上に表示され、マーカーを使用してフォーカスの位置をマークします。これは、フォーカス上に配置されたときに水でいっぱいになり、中央の穴とプレートを使用して行うことができます。変換器の軸方向の座標が水面から決定することができますが水で満たされた穴は、MRI上に表示されますと2面での焦点の座標を提供します。
- 3面のローカライザーシーケンスを使用して画像の焦点マーカーとMRI座標系でのフォーカスの位置を記録します。
- アコースティックエミッションを監視するには、トランスデューサの焦点に向け水浴中で受動的なキャビテーション検出器（PCD）として使用されているMR-互換性のあるハイドロ8をマウントするか、統合されたハイドロフォンのトランスデューサーを使用しています。
- 最大2 Hzの（例えば、ATS460、AlazarTech、ポワントクレア、ケベック州、カナダ）へのPRFが10ミリ秒までのバーストを捕捉するのに十分高速であるスコープのカードにPCDケーブルを実行します。ケーブルはPENEに接地する必要がありますtrationパネルまたはRFシールドは、ノイズを最小限に抑えます。
2。動物の準備
- イソフルランガスを使用して動物を麻酔。イソフルランは、BBBの破壊10の効果を持っているので、動物実験の開始前にガスは10分をオフに注意する必要があります。乾燥や他の傷害から角膜を保護するために、麻酔の開始時に各目の場所の眼潤滑剤軟膏。
- 動物の頭と首の上から毛を剃る電気かみそりを使用して、その後脱毛クリーム（例えばNairさんは、教会＆ドワイト社、プリンストン、ニュージャージー州、米国）を使用して、残りの毛を除去し、穏やかな石鹸で頭皮をすすぎ、水。
- bridine洗浄に続いてbetadineスキンスクラブと尾を準備します。尾静脈を可視化するために、アルコールとの最終wipedownを実行します。
- 尾静脈に3方活栓と22ゲージのカテーテルを挿入し、血栓形成を防止するために、ヘパリン/食塩水混合物（33 U / mL）でフラッシュカテーテルインチ
- 筋肉内注射により、注射麻酔薬（40〜50 mg / kgのケタミン、10 mg / kgのキシラジン）を提供し、イソフルランから動物を削除します。
- トッププレート（図1）の穴を通して水浴の接触の頭の上で超音波測位システムにおける麻酔動物を仰臥位に置きます。超音波ゲルの少量多分トラップairbubblesの可能性を最小限に抑えるために動物の頭の上に適用されます。
- 位置決めシステムへのテープの足を。頭のいずれか一口バーを使用して、場所で開催された、利用可能な場合、またはテープがあご全体にしっかりと置かれるかもしれません。
- タオルで動物をカバーし、それを暖かく保つために水の毛布を循環させる。
3。標的選択
ベースラインの軸方向のT 2-Tと重み脳の1加重MR画像を取得します。 1.5 T MRIと専用のヘッドサイズのRF-受信表面コイル、適切なSCを使用している場合パラメータは次のようになります。
加重T 2：FSE、TE = 60ミリ秒、TR = 2000ミリ秒
加重T 1：FSE、TE = 10ミリ秒、TR = 500ミリ秒- 心室、脳の正中線を避けて、中脳の深さを選択し、T 2-加重スキャンからターゲットを選択します。
- ターゲットの場所にトランスデューサのフォーカスを移動します。
4。マイクロバブルの準備
DEFINITYマイクロバブル（Lantheusメディカルイメージング、MA、米国）がBBBD 2,5,7を誘発したマイクロバブル媒介FUSのために、いくつかのグループによって使用されます。他のマイクロバブルの種類の適切な投与量は、文献11,12に記載されています。
- のDefinityマイクロバブルを活性化し、徐々に18ゲージ針を用いて1 mLシリンジに小さな音量を上げて描画します。
- 軽く前後にプランジャーを移動することによってシリンジから閉じ込められた空気を削除します。これは気泡を破ることができるように注射器をタップしないでください。
- 正常な内のDEFINITYを希釈徐々に生理食塩水のシリンジにDEFINITYの必要量を注入することによりDefinty〜10:1生理食塩水の割合で生理食塩水。注入配信が使用されている場合、DEFINITYは、50:1または100:1、さらに希釈することができる。
- 優しくても外観が達成されるまで、徹底的にのDefinityと生理食塩水を混ぜて注射器を反転させます。気泡が懸濁液からフロートを開始した場合、直ちに注入前にシリンジの緩やかな反転が必要になることもあります。
- のDefinityの0.02 ml / kgの、または溶液（10:1希釈）0.2 ml / kgの用量に基づいて、必要な量を計算します。
5。超音波配信
- 低デューティ·サイクルのバーストではなく、連続波sonicationsを使用して、超音波処理パラメータを設定します。 0.5 MHzで、適切な超音波処理パラメータは、 その場の圧力0.23 MPaで、1 HzのPRF、2分間で10ミリ秒のバーストです。合計超音波処理時間。 その場の圧力は 1.5 MHzでの適切な0.45から0.5 MPaの周りに分類されます。
- 動物の頭はまだ水に結合されていることを確認してください。
- 尾静脈カテーテルにゆっくりとマイクロバブルを注入し、0.5 mLの生理食塩水で洗い流してください。注入開始と同時に超音波処理を開始します。
6。治療成績のMRI評価
- 超音波処理後、0.5 mLの生理食塩水フラッシュに続いて、尾静脈カテーテルを介して（例えば0.2ミリリットル/ kgのOmniscan、GEヘルスケア）MRI造影剤を注入します。
- コントラストのピークが経過するまで、T 1強調画像を実行します。首尾よく破壊された超音波のサイトが周囲の組織よりも大きい増強が表示されます。
- 浮腫を確認するためにT 2強調画像を実行します。超音波処理現場での高信号は、浮腫の指標である。
7。代表者結果
MRI造影剤は正常に集束超音波とマイクロバブル循環を使用して、BBBを介して配信することができます。図2は、典型的なプリおよびポストFUS T 1-Wの画像を示しています。図2Bは、4つの超音波処理した場所で異なった焦点距離の開口部とは対照的に強化された（CE）T 1-Wイメージを示しています。超音波位置1と2は特に明るい強化を示しています。図の位置1と2にも浮腫を示し、T 2-W高信号に対応するように見ることができます。
T 2-wの浮腫の程度は、時には矢状スライスに、より簡単に視覚化することができます。図4は、CE-T 1-wとT 2は、-w矢状スライス超音波位置1〜3を示しています。浮腫は位置1ではなく位置3で表示されます。
キャプチャされたアコースティックエミッションデータ（図5）のスペクトル解析では、高調波の排出量および/または安定したキャビテーションが発生している超/サブハーモニックの排出量が表示される場合があります。ハーモンsubとultraharmonic排出量はバブルのアクティビティ14の結果としてのみ発生することができますがICはまた、組織の非直線性から生じる可能性があります。より高い圧力で慣性キャビテーションを示す広帯域の排出量も検出することができます。しかし、これらは、慣性キャビテーション11なしsonicationsより赤血球extravasationsと微小損傷の大きい量に関連付けられている。
小さな焦点スポットサイズに起因する多くのローカライズされた開口部に高い超音波周波数を使用した結果。図6は、高い周波数は、開口部の小さな領域を作成するために使用できることを示しています。これは、より少ない近い頭蓋骨の影響と効果半ば脳の調査を可能にします。
図1実験セットアップ。
図2。前（左）と後（右）の治療法T 1-W 4超音波の位置で強化を示すラットの脳の画像。
（3）前（左）と後（右）の治療法T 2-Wラットの脳の画像（図2と同じ動物）は、超音波位置1と2で、T 2は、-w浮腫を示す図 。
図4後処理矢T 1-W（左）とT 2-W（右）同じラットの脳からの画像は、図。 2と3。位置1の開口部（左）T 2-wの浮腫（右）と相関しています。場所3は、開口部（左）がないT 2は、-w浮腫を示しています。 
図5：551.5 kHzで1つの10ミリ秒のバースト中に捕捉したデータから周波数スペクトル。基本周波数（f 0）と同様に高調波（2 F 0）とultraharmonics /サブ（0.5 F 0、1.5 F 0）が表示されます。
図6治療後CE-T 1-W軸（左）と1.503 MHzで4箇所に超音波処理したラットの脳から矢（右）の画像。この周波数でのBBBの開口部は、よりローカライズされたように見られている。
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Discussion
動物とマイクロバブルの準備は、この手順の中で最も重要な側面です。動物の頭の毛は完全に超音波ビームの減衰を避けるために削除する必要があります。 BBBは、イソフルラン麻酔下で中断される可能性があります、しかし、それは一貫性のある開口部を達成するために難しくなります。
マイクロバブルは、常にそれらを壊すことを避けるために、策定時に大径の針を使用する必要があり、ケア、小さなゲージで処理する必要があります。同様に、合理的に尾静脈に使用することができる最小のゲージのカテーテル（22ゲージをお勧めします）を採用する必要があります。小さいカテーテルを静脈内に適切な配置を達成するために必要されている場合、余分なケアがマイクロバブル注入時に注意する必要があります。マイクロバブル注入は常に徐々に行う必要があります。
バーストモードsonicationsは、常に使用すべきである。連続波sonicationsが使用されている場合はバブルが補充されませんにトランスデューサの焦点とBBBDの船舶が達成されることはありません。 CE-T 1-W画像を後処理では混乱を示していない場合は、治療法は、水のレベルが動物の頭部が皮膚表面上に捕捉されたに気泡が存在しないことを水の中で、なるように補充しているかどうかを確認を繰り返すことができる。
高い周波数では小さな動物モデルで優れたローカリゼーションを提供しますが、開口部を誘導するためにその場の圧力でより高い必要があります。それは頭蓋骨に起因する損失は、より高い圧力で高くなって、その場の圧力で推定する際に考慮する必要があることを考慮することも重要です。ラットの頭蓋骨を介して0.5 MHzの伝送は約73％は8ですが、1.5 MHzで約50％から15に低下します。減衰は、脳組織4 5 NpはM -1 MHzの-1であると仮定することができます。高い周波数では小さな動物モデルでの作業のために適しているが、以下の臨床的に関連しています。
テント ">このMRI誘導のアプローチは、ターゲットと非常に正確なだけでなく、すぐに治療結果の評価後処理を可能にすることで、超音波ガイド下の技術上の利点を提供します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K. HynynenとR.チョプラがFUS·インスツルメンツの共同設立者であり、株式会社R.チョプラ、A. WaspeとK. HynynenはFUSインスツルメンツでは株主である株式会社K. HynynenはFUSの楽器、（株）からの研究支援を受け
Acknowledgments
著者らは、動物のケアとの助けをShawnaリドー·グロスとアレクサンドラガルセスに感謝し、彼女の技術支援のためのPing呉だろう。この作業のサポートは、助成金なしで、米国立衛生研究所によって提供されました。 EB003268、カナダ研究チェアプログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Animal Focused Ultrasound System | FUS Instruments, Inc. | RK-100 | |
| Definity | Lantheus Medical Imaging | ||
| Omniscan | GE Healthcare |
References
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11719-11723 (2006).
- Jordão, J. F., Ayala-Grosso, C. A., Markham, K., Huang, Y., Chopra, R., McLaurin, J., Hynynen, K., Aubert, I. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 5 (5), e10549-e10549 (2010).
- Liu, H. -L., Hua, M. -Y., Chen, P. -Y., Chu, P. -C., Pan, C. -H., Yang, H. -W., Huang, C. -Y., Wang, J. -J., Yen, T. -C., Wei, K. -C. Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment. Radiology. 255, 415-425 (2010).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Choi, J. J., Wang, S., Tung, Y. -S., Morrison, B., Konofagou, E. E. Molecules of various pharmacologically-relevant sizes can cross the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in vivo. Ultrasound Med. Biol. 36, 58-67 (2010).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound Med. Biol. 35, 1298-1308 (2009).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. A PVDF receiver for ultrasound monitoring of transcranial focused ultrasound therapy. IEEE Trans. Biomed. Eng. 57, 2286-2294 (2010).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Med. Phys. 36, 1867-1874 (2009).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-Brain Barrier Disruption and Vascular Damage Induced by Ultrasound Bursts Combined with Microbubbles can be Influenced by Choice of Anesthesia Protocol. Ultrasound Med. Biol. , (2011).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Yang, F. -Y., Liu, S. -H., Ho, F. -M., Chang, C. -H. Effect of ultrasound contrast agent dose on the duration of focused-ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. J. Acoust. Soc. Am. 126, 3344-3349 (2009).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med. Biol. 34, 834-840 (2008).
- Neppiras, E. A. Acoustic Cavitation. Physics Reports (Review Section of Physics Letters). 61, 159-251 (1980).
- O'Reilly, M. A., Huang, Y., Hynynen, K. The impact of standing wave effects on transcranial focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier in a rat model. Phys. Med. Biol. 55, 5251-5267 (2010).
