השיטה של שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.
מצב מוצק nanopores שימשו כדי לבצע מדידות ברמת יחיד המולקולה לבחון את מבנה הגמישות המקומית של חומצות גרעין 1-6, את התגלגלות של חלבונים 7, זיקה מחייבת של ligands שונים 8. על ידי צימוד אלה nanopores לטכניקה הדופק התנגדות, 12/09, מדידות כאלה ניתן לעשות זאת תחת מגוון רחב של מצבים רחב ללא צורך תיוג 3. בטכניקה התנגדות, דופק, פתרון מלח יוניים הוא הציג על שני הצדדים של nanopore. לכן, יונים מונעים מצד אחד של החדר לצד השני על ידי פוטנציאל הטרנסממברני מיושם, וכתוצאה מכך זרם יציב. חלוקת אנליטי לתוך nanopore גורמת סטיה מוגדרת היטב בזרם זה, אשר ניתן לנתח כדי לחלץ מידע יחיד מולקולה. באמצעות טכניקה זו, ספיחה של חלבונים יחיד על הקירות nanopore יכול להיות פיקוח תחת מגוון רחב שלהתנאים 13. חלבון ספיחה גוברת בחשיבותו, כי כמו מכשירים microfluidic לכווץ בגודל, את האינטראקציה של מערכות אלה עם חלבונים יחיד הופך לדאגה. פרוטוקול זה מתאר assay מהיר של חלבון מחייב סרטים ניטריד, אשר יכול בקלות להיות מורחבת סרטים דקים אחרים מקובל קידוח nanopore, או משטחים ניטריד פונקציונליות. מגוון של חלבונים עלול להיחקר תחת מגוון רחב של פתרונות ותנאי denaturing. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור יותר בעיות בסיסיות באמצעות ספקטרוסקופיית nanopore.
ספיחה ספונטנית של חלבונים על מצב מוצק משטחים 27-29 חשוב ביסודו במספר תחומים, כגון יישומים biochip ועיצוב של מעמד חדש של biomaterials היברידית תפקודית. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים adsorbed כדי מצב מוצק משטחים לא מראים הניידות לרוחב או שיעורי desorption משמעותי, ולכן חלבון ספיחה נח…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות ג'ון Grazul (אוניברסיטת קורנל), אנדרה Marziali (האוניברסיטה של קולומביה הבריטית ונקובר ב) ו – וינסנט התחפושת-Cossa (מאוניברסיטת אוטווה) עבור עצתם. עבודה זו ממומנת בחלקה על ידי תרומות של המוסד האמריקני למדע (DMR-0706517 ו DMR-1006332) לבין המכון הלאומי לבריאות (R01-GM088403). הקידוח nanopore בוצעה במתקן מיקרוסקופית אלקטרונים מרכז קורנל עבור חומרים מחקר (CCMR) בתמיכת הקרן הלאומית למדע – חומרים מדע והנדסה מרכזי מחקר (MRSEC) בתוכנית (DMR 0,520,404). הכנה של ממברנות סיליקון ניטריד בוצעה במתקן ננו קורנל, חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק ECS-0335765).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
potassium chloride | Sigma | P9541 | |
potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
hot plate | Fisher Scientific | ||
Faraday cage |