1. Forbered Fixative (Se tabell Fixative og buffere.) 2. Forbered perfusjon buffere (Se tabell Fixative og buffere.) 3. Forbered Apparatus og anestesi Bruke vannbad, varm perfusjons buffer til 37 ° C. Plasser Utløpsventilen i et begerglass fylt med buffer. Fyll en 50 ml sprøyte med buffer og fest fiksativ tubing. Skyll slangen gjentatte ganger ved å utvise og trekke buffer. Fjern linjen med buffer inntil alle luftbobler i slangen er eliminert. Det er avgjørende for suksessen til en perfusjons ikke å ha luftbobler i noen av linjene. Fjern sprøyten og koble 4% paraformaldehyde fiksativ (romtemperatur) beholder. For å unngå luftbobler i slangen slutt, klemme røret mens plassere slangen inn i beholderen slik at en dråpe buffer stikker fra slutten to kontakte væske overflate i beholderen. Lukk utblåsningsåpningen (nål slutten). Slå buffer ventil (blå) til samme posisjon som bindemiddel ventilen (hvit). Dette vil gi strøm fra buffer linje bare. Åpne utblåsningsåpningen og gjenta trinn A1 gjennom A3 for å fylle bufferen linjen. Etter at alle luftboblene er eliminert tett utblåsningsåpningen, fjern sprøyten og koble buffer beholderen, tar seg ikke å innføre luftbobler inn i slangen. Test system for evnen til å holde trykket ved å pumpe den gummi manometeret blub. Det er normalt litt motstand på grunn av kompresjon av luft i systemet. Oppsett kirurgi verktøy i orden for enkel tilgang. Fyll perfusjon nål med buffer for å eliminere muligheten for luftbobler. Før kirurgi, er en ketamin / xylazin blanding (opp til 80 mg / kg kroppsvekt ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt xylazin) administreres via intraperitoneal injeksjon (27 gauge nål og en cc sprøyte). Ekstra tilførsel av bedøvelse vil bli utført etter behov i løpet av hver operasjon for å opprettholde en kirurgisk fly av anestesi. 4. Perfusjon Kirurgi Når dyret har nådd en kirurgisk flyet av anestesi, plasser den på grunt skuffen fylt med knust is. (Bruk tå klype-respons metoden for å bestemme dybde av anestesi. Dyret skal ikke svarer før du fortsetter). Lag en 5-6 cm lateralt snitt gjennom integument og bukveggen like under ribbeina. Forsiktig skille leveren fra mellomgulvet. Lag et lite snitt i mellomgulvet med de buede, butte saks. Plasseringen og trykket fingeren kan hjelpe i muligheten til å kutte mellomgulvet. Fortsett membranen snitt langs hele lengden av brystkassen for å avdekke pleurahulen. Plasser buede, butte sakser langs den ene siden av ribbeina, nøye fortrenger lungene, og lage en cut gjennom brystkassen opp til kragebeinet. Lag en lignende kutt på motsatt side. Løfte sternum bort, nøye trimme noe vev å koble den til hjertet. Klem brystbenspissen med hemostat og plasser hemostat over hodet. Når det gjøres riktig, løfter thymus vekk fra hjertet sammen med brystbenet, og gir et klart bilde av de store fartøyene. Lag et lite snitt i bakre enden av venstre ventrikkel med iris saks. Klikk her for å se større figur . Pass en 15-gauge sløv-eller oliven-tipped perfusjon nålen gjennom kutt hjertekammer i aorta ascendens. Spissen skal være synlig gjennom veggen av aorta, og bør ikke nå aortabuen der brakiale og carotis divergerer. Bruk en hemostat å klemme hjertet, sikrer denne nålen og hindrer lekkasje. Hvis ønskelig, kan den endres hemostat brukes til å klemme aorta rundt nålespissen (disse hemostats forbli på plass til disseksjon starter, men er utelatt fra framtidige illustrasjoner for klarhet). Til slutt, gjør et snitt til dyrets høyre atrium med iris saks til å skape så stor en stikkontakt som mulig uten å skade synkende aorta. På dette punktet dyret er klar til å bli perfused. 5. Perfusjon Åpne og fest utgangsporten til p basen tar seg ikke å innføre noen luftbobler. Pump opp manometeret pære til et trykk på 80 mm Hg raskt og jevnt. Oppretthold dette trykket gjennom hele bufferen infusjonsperioden. Starte tidtakeren. Juster nålen vinkel. Vinkelen på nålen er avgjørende for oppnåelse av en maksimal strømningsrate (merk flyten endringen med justerbar vinkel). Slå av buffER ventil (blå) når buffer er nesten ferdig (200 ml). Væsken skal kjøre tydelig. Clearing av leveren er en indikator på en god perfusjon. Leveren skal være klar på dette punktet. Indikerer tid for dine poster. Fiksering rystelser bør observeres i løpet av sekunder, og dette bør vurderes den sanne tid fiksering. Indikerer tid for dine poster. Trykket kan gradvis bli økt opp til maksimalt 130 mm Hg 2 for å opprettholde en jevn flyt rate. Lukk utløpsventilen når bindemiddel er nesten ferdig. Indikere sluttidspunkt for dine poster. Rotta skal være stiv på dette stadiet. Den brukte paraformaldehyde må samles og lagres for deponering i henhold til reglene i institusjon. 6. Disseksjon 4,11 Fjern hodet ved hjelp av en saks. Lag en midtlinjen snitt langs integument fra nakken til nesen og utsettskallen. Skjær av gjenværende hals muskelen, slik at bunnen av hodeskallen er eksponert; fjerne alle rester av muskel bruker saks eller Rongeurs. Plasser den skarpe enden av et par iris saks inn i foramen magnum på den ene siden, forsiktig glir saksen langs den indre overflaten av skallen. Neste, et snitt som strekker seg til den distale kanten av bakre skalle overflaten. Lag en identisk kutt på motsatt side. Bruk Rongeurs å rydde vekk skallen rundt lillehjernen. Skyv saksen langs den indre overflaten av hodeskallen som spissen reiser fra dorsal distale bakre hjørne til distale frontal kanten av skallen, løfte opp på bladet som du kutter for å hindre skade på hjernen. Gjenta for motsatt side. Bruke Rongeurs skrelle framsiden av hodeskallen vekk fra hjernen. Trim vekk sidene av skallen med Rongeurs også. Ved hjelp av en slikkepott, kutte olfactory blomsterløk og nervøs forbinsjoner langs baksiden av hjernen. Forsiktig erte hjernen bort fra hodet, trimming enhver dura som fortsatt forbinder hjernen til hodeskallen ved hjelp av iris saks. Fjern hjernen og legg den i en ampulle med bindemiddel holdig væske minst 10x volumet av hjernen selv. Swirl hetteglasset innimellom. 7. Post-fiksering og lagring Hold hjernen i bindemiddel i 24 timer ved 4 ° C, virvlende og til. Etter 24 timer, vask hjernen med fosfat saltløsning ved å utveksle media 3 ganger og virvlende hver gang. Hjerner kan deretter lagres i fosfatbufret saltvann eller HBHS med natriumazid og oppbevares ved 4 ° C. 8. Representative Resultater En første indikator på suksessen til perfusjons er clearing av ekstremiteter som nese, ører og poter og indre organer som thymus kjertelen og leveren (IHC World).Brutto inspeksjon av hjernen avslører blodåre blottet for blod (hvit til blek gul utseende). Dette vil også være sant innenfor vevsdelene forutbestemme til farging og immunhistokjemi. Den endelige indikator utfallet av perfusjons er tilstanden til ultrastructure i vevet. 1,6,7,8 Forbered Fixative: Forbered 8% Paraformaldehyde lager Legg 40 g Paraformaldehyde til 500 ml dH 2 O. Varm løsningen til 60 – 65 ° C under omrøring (Ikke overstig 65 ° C, gjør dette kan påvirke suksessen av immunhistokjemisk prosedyren). For å fjerne løsningen, reduser varmen og tilsett 2-3 ml av 1,0 M NaOH med en dropper. Filter og oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned. Forbered 0,2 M natriumfosfat Buffer, 7,4 pH For natriumfosfat monobasic lager, legger 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O til en L dH 2 O. For natrium Dinatriumhydrogenfosfat lager, legger 28,4 g Na 2 HPO 4-1 L dH 2 O. Legg 810 ml av monobasic lager til 190 ml av dibasic lager. Forbered 4% Paraformaldehyde Fixative Legg like store deler 8% paraformaldehyde lager til 0.2m Sodium fosfatbuffer Merk: denne reparasjonen er best forberedt frisk, ikke mer enn 72 timer i forveien. Forbered Perfusjons og bagasje buffere: Forbered Fosfatbufret Saline, pH 7,4 1 L dH 2 O 9 g NaCl 144 mg KH 2 PO <sub> 4 795 mg Na 2 HPO 4 Sjekk pH HEPES Buffered Hanks Solution (HBHS) med natriumazid pH 7,4 990 ml dH 2 O 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl 0,06 g KH 2 PO 4 0,13 g Na 2 HPO 4 2 g Dextrose / Glukose 2,4 g 10 mm Hepes 0,1 g MgCl 2 6 deler dH 2 O 0,05 g MgSO 4 7 deler dH 2 O 0,165 g CaCl 2 2 deler dH 2 O 90 mg NaN 3 Sjekk pH Tabell 1. Forberedelse av Fixative og buffere. Figur 1. </strong> Perfusjons Apparatus med merket komponenter. Figur 2. Forberedelse av Perfusjons Apparatus I. Begynn med fiksativ linjen. Skyll slangen av luftbobler og fyll med buffer ved raskt å utvise og uttak buffer i sprøyten og gjennom linjen. Steng ventilen på p. enden av. Plasser fiksativ linje i fiksativ flasken uten å innføre luftbobler. Figur 3. Forberedelse av Perfusjons Apparatus II. 1. Åpne ventilen på pinnen slutten. 2. Slå buffer ventil (blå) for å posisjonere for flyt. 3. Skyll slangen av luftbobler og fyll med buffer ved raskt å utvise og uttak buffer med sprøyten. 4. Steng ventilen på pinnen slutten. Plasser slangen inn i den bufferen flasken. Test press for å sikre at systemet er tett riktigly ved å pumpe opp manometeret pære og se måleren. Apparatet er nå klar for perfusjon prosedyren. Figur 4. Perfusjons Apparater i posisjon for buffer levering. Figur 5. Perfusjons Kirurgi I. a) Lag en lateral snitt gjennom integument og bukveggen. b) Lag et snitt i mellomgulvet og skjær over membranen utsette hjertet. Lag parallelle kutt på hver side av ribbene opp til kragebeinet. c) klemme spissen av brystbenet med hemostat og plasser hemostat over hodet. Figur 6. Perfusjons Kirurgi II. a) Før perfusjon nålen gjennom kutt hjertekammer i aorta ascendens. b) Sikreperfusjon nålen bruk ett sett av hemostats å klemme hjertet. Et annet sett av en modifisert hemostat kan også brukes til å klemme aorta rundt nålespissen å forhindrer lekkasje. Bruke iris saks lage et lite snitt i bakre enden av venstre ventrikkel. Figur 7. Perfusjons med buffer Pump manometeret pære å skape trykk i linjen. Åpne opp ventilen (1) og fester seg til nålen hub. Det er avgjørende å sørge for at ingen luftbobler er innført. Pump opp manometeret pære til et trykk på 80 mm Hg og opprettholde dette trykket gjennom hele bufferen infusjonsperioden. Figur 8. Perfusjons med Fixative Når bufferen er nesten ferdig (200 ml) slår bufferen ventilen (1) for å tillate fiksativ til å flyte. Trykket kan gradvis økes opp til enmaksimalt 130 mm Hg. Figur 9. Dissection I. a) fjerne hodet ved hjelp av et par saks. b) gjøre et snitt i huden langs midtlinjen fra nakken til nesen og avsløre skallen. c) klippe av gjenværende hals muskelen, slik at bunnen av hodeskallen er utsatt. Hold hodet slik at den store åpningen i kraniet overflaten (foramen magnum) er tilgjengelig. Forsiktig inn den skarpe enden av et par iris saks inn i foramen magnum og gjør et kutt. Gjenta det samme manøver for motsatt side. Bruk Rongeurs å rydde vekk skallen rundt lillehjernen. Figur 10. Dissection II. a) skyv saksen langs den indre overflaten av skallen. Løft opp på spissen når du kutter for å hindre skade på hjernen. Gjenta det samme formotsatt side. Bruk Rongeurs skrell skallen vekk fra hjernen. b) illustrasjon med skallen fjernet og hjernen utsettes. c) Bruk en slikkepott til å kutte olfactory blomsterløk og nerve tilkoblinger på det mest anterior plassering av hjernen. Forsiktig lede spatelen spissen langs undersiden av hjernen å kutte forbindelser for enkel fjerne. Fjern hjernen og legg den i en ampulle med bindemiddel.