Summary
Beskriver vi en række assays til at analysere ekspressionsniveauer af H1 linker histoner. mRNA individuelle H1 gener kvantitativt ved tilfældig primer baseret revers transkription efterfulgt af real-time PCR, hvorimod protein kvantificering af H1 histoner opnås ved HPLC-analyse.
Abstract
Linkeren histon H1 binder til nukleosom kernepartikel og linker-DNA, der letter foldningen af kromatin i højere orden struktur. H1 er afgørende for pattedyr udvikling 1 og regulerer genekspression in vivo 2-4. Blandt de højkonserverede histon proteiner, er familien af H1 linkersekvenser histoner mest heterogen gruppe. Der er 11 H1 undertyper i pattedyr, der differentielt reguleret under udvikling og i forskellige celletyper. Disse H1 undertyper omfatter 5 somatiske H1S (H1A-e), udskiftning H1 0, 4 kønsceller specifikke H1 undertyper, og H1x 5. Tilstedeværelsen af multiple H1 undertyper, der afviger i DNA bindingsaffinitet og chromatin kompaktering evne 6-9 tilvejebringer et yderligere modulation af kromatin funktion. Således kvantitativt udtryk analyse af de enkelte H1 undertyper, både mRNA og proteiner, er nødvendig for en bedre forståelse af reguleringen af højereFor chromatin struktur og funktion.
Her beskriver vi en række assays designet til at analysere ekspressionsniveauerne af individuelle H1 undertype (figur 1). mRNA-ekspression af forskellige H1 variantgener måles ved en række af meget følsomme og kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) assays, der er hurtigere og mere præcis og kræver meget mindre prøver sammenlignet med den alternative fremgangsmåde til Northern blot-analyse. I modsætning til andre cellulære mRNA meddelelser, mangler mRNA'er for de fleste histon gener, herunder størstedelen af H1 gener, en lang polyA hale, men indeholder en stilk-loop-struktur i 3'-utranslaterede region (UTR) 10. Derfor er cDNA'er fremstillet fra totalt RNA ved revers transkription under anvendelse af tilfældige primere i stedet for oligo-dT-primere. Realtid PCR-assays med primere specifikke for hver H1 undertype (tabel 1) udføres for at opnå meget kvantitativ måling af mRNA-niveauer af individuelle H1 undertypesek. Angivelse af rengøring gener analyseres som kontrol for normalisering.
Den relative rigelighed af proteiner af hver H1 undertype og kerne histoner opnås ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC)-analyse af totalt histoner ekstraheret fra pattedyrceller 11-13. HPLC-metoden og elueringsbetingelser beskrevet her give optimale separation af muse H1 undertype. Ved kvantificering HPLC profil, beregner vi den relative andel af de individuelle H1 undertype i H1 familien, såvel som bestemmelse af H1 nukleosom forholdet i cellerne.
Protocol
1. Prøvefremstilling og RNA-ekstraktion
- Før RNA-ekstraktion, skal alle arbejdsflader og pipetter aftørres med 70% ethanol og behandlet med RNase dekontaminering opløsning, såsom RNase Zap. Denne fremgangsmåde reducerer chancerne for RNase kontaminering og RNA-nedbrydning. Brug handsker for alle procedurer.
- At ekstrahere RNA fra musevæv, dissekere organet af interesse fra aflivet mus, og vask af vævet i iskold phosphatpufret saltvand (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM dibasisk natriumphosphat heptahydrat, 5 mM natrium-dihydrogenphosphat heptahydrat, pH 7,4) . Fortsæt straks til RNA ekstraktion i trin 1,4. Hvis frisk væv ikke vil blive behandlet for RNA-ekstraktion, bør vævsprøver være lynfrosset i flydende nitrogen umiddelbart og opbevares ved -80 ° C til senere brug.
- Hvis RNA kan ekstraheres fra adhærerende cellekultur, aspireres dyrkningsmedier, skylles med en tilstrækkelig mængde af PBS, og der tilsættes Trizol-reagens (in vitrogen) på pladen og fortsæt til trin 1,4. For celler dyrket i suspension, høste cellerne og Udpelleter cellerne ved centrifugering. Skille medier, skylles pellets kort med PBS, og pelletere cellerne med centrifugering. Tilføj Trizol Reagens og fortsæt til trin 1,4.
- Tilstrækkelig Trizol-reagens er nødvendig til opnåelse af høj kvalitet RNA. Anvende 1 ml Trizol-reagens til at ekstrahere RNA fra 50 til 100 mg væv, 5 - 10 x 10 6 celler (for suspensionskulturer) eller pr 3,5 cm plade (for adhærente kulturer). Homogenisere vævet i Trizol-reagens med Polytron PT2100 homogenisator (eller tilsvarende). Fortsæt til ekstraktion af RNA fra vævsprøver eller celler i overensstemmelse med producentens manual for Trizol Reagens (Invitrogen).
- RNA-koncentrationen måles ved anvendelse Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) og RNA kvalitet analyseres ved gelelektroforese. De typiske udbytteintervaller fra 1-10 ug af RNA per mg væv og 5-15 ug af RNA pr 1 x 10 6 dyrkede celler. At fjernepotentiel forurening af RNA fra spormængde af genomisk DNA, RNA-prøver behandlet med RNase-fri DNase (Sigma AMP-D1) ifølge producentens anvisninger. Gentages RNA koncentrationsbestemmelse og gelelektroforese at sikre, at ingen nedbrydning af RNA fra denne behandling. Store ekstraheret RNA ved -80 ° C.
* Bemærk: RNA kan også ekstraheres med RNAeasy kit (Qiagen) ifølge kit manuelle eller ved DNA / RNA-kittet (Qiagen), hvis både DNA og RNA er ønsket.
2. Kvantitativ revers transskription PCR (QRT-PCR)
- Totalt RNA revers transkriberet til cDNA under anvendelse Superscript III første-streng syntese System (Invitrogen). Idet mRNA fleste H1 gener mangler poly-A-haler, er det kritisk at anvende tilfældige hexamerer i stedet for oligo-dT som primere for cDNA-syntese. Hvis ekspression analyse af gener med polyadenylerede meddelelser ved lave niveauer også ønskes, en blanding af vilkårlige hexamerer og oligo-dT Should anvendes i revers transkription (RT) reaktion for at forbedre revers transkription effektivitet polyadenylerede mRNA.
- Udføre RT-reaktionen ifølge producentens vejledning. Kort fortalt,
- I en 0,5 ml PCR-rør, kombinerer 5 ug af total RNA, 1 pi af 50 ng / ul tilfældige hexamerer, 1 pi 10 mM dNTP-blanding, og der tilsættes DEPC-behandlet H2O til et samlet reaktionsvolumen som 10 ul. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 65 ° C, efterfulgt af 1 min inkubation på is.
- Fremstilling af 10 ul cDNA Synthesis Mix: 2 pi 10xRT buffer, 4 gl 25 mM MgCl2, 2 pi 0,1 M DTT, 1 pi RNaseOut (40 U / ul), 1 pi af SuperScript III RT (200 U / pi), og føje det til RNA / primer blanding.
- Inkuberes i 10 minutter ved 25 ° C, efterfulgt af 50 minutter ved 50 ° C og afsluttes reaktionen ved 85 ° C i 5 minutter.
- Hver reaktion giver typisk 100-250 ng / ul cDNA-produkt. Oplagre cDNA-produkter ved -20° C eller fortsætte umiddelbart for real-time kvantitativ PCR (qPCR).
- qPCR kan nøjagtigt kvantificere målsekvensen kopier med høj effektivitet og reproducerbarhed 14. Vi vælger qPCR målt ved SYBR Green farvestof, som giver et fluorescerende signal, når det interkalerer med dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Selvom det ikke er så specifik som Taqman assay 14, er denne metode mere omkostningseffektivt, lettere at blive vedtaget i laboratoriet, og giver mere alsidighed til qPCR. Derfor er det vigtigt at undersøge amplifikation plot (fig. 2A) og de afledte smeltekurver af qPCR produktet (figur 2B) for at sikre reaktion effektivitet og specificitet.
| Histon-undertyper | Mus histon nomenklatur | Menneskelig histon nomenklatur | ||
| Gene navn | Accessionsnr. | Gene navn | Accessionsnr. | |
| Histon-H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histon-H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histon-H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histon-H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histon-H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histon H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histon-H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histon-H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histon-H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histon-H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histon Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tabel 1. Histon H1 undertype nomenklatur i mus og menneske.
- Design fremad og omvendte PCR-primere der var specifikke for hver H1-genet (tabel 1). På grund af den høje sekvenslighed mellem somatisk H1S, især i området svarende til det centrale globulære domæne, er det vigtigt at sikre, at primerne designet til et særligt H1 undertype ikke på linie med ondre H1 gener, eller krydser forstærke andre H1 undertyper. Det er også vigtigt at bemærke, at de fleste H1 gener ikke indeholder introns. Således intron-spænder primere typisk er vedtaget for RT-PCR for at undgå genomisk forurening er ikke tilgængelige. I stedet bør RNA-prøver forbehandles med DNase (se 1.5) at fjerne enhver spormængde af genomisk kontaminering. Endvidere, RT (-) bør-qPCR udføres i parallel for at validere den manglende genomiske kontaminering i cDNA prøverne.
- Også designe primere til interne referenceformål gener, hvis udtryk er ikke ændret blandt prøver. Ofte rengøring gener, såsom glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) og beta-actin-gener, er valgt som reference gener. qPCR signaler housekeeping-gener tjener som normalisering kontroller.
- Fremstilling af hver PCR-reaktion (totalt volumen 25 ul) som følger: 12,5 gl 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (indeholdende dNTP'er, 50 U / ml iTaq DNA-polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I og 20nM fluorescein), 2 ul 4 ng / ul cDNA, 1,25 pi af 10 nM fremad / reverse primer mix, og 9,25 gl ddH2O, og bland godt i Microseal 96-brønds PCR-plade. Anvende Microseal B-klæbende tætninger (Bio-Rad) for at sikre, at pladen dækslet er forseglet til pladen. Tryk eller kortvarigt vortex PCR pladen, og spin ned reaktionsblandingerne ved en kort centrifugering. Pladen anbringes i MyIQ Single Color real-time PCR Detection System (Bio-Rad) for qPCR.
- Vi anvender følgende qPCR betingelser: 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder. Undersøge amplifikation kurver (fig. 2A) til PCR effektivitet og Ct (Threshold af cyklus) værdier. Tærsklen linie kan automatisk af IQ5 Optical System Software Version 2,0.
- Primeren effektivitet og optimal cDNA koncentration nødvendigt kan testes ved en standardkurve assay, i hvilket en seriefortynding af genomisk DNA is bruges til qPCR og Ct-værdier er plottet mod log af template-DNA beløb. En optimeret qPCR assay med primere med høj specificitet og effektivitet vil give en lineær standardkurve med determinationskoefficienten (R2)> 0,98. Undgå primere med amplicon længde er længere end 200 bp, der har tendens til at have dårlig virkningsgrad for forstærkningen.
- Fordi SYBR Green detekterer ethvert dsDNA, er det vigtigt at foretage en smeltekurve løb efter qPCR at sikre, at den ønskede amplikon, men ikke primerdimerer eller forurenende stoffer, der amplificeres og detekteres. For smelte-kurve analyse programmet qPCR instrument til at opvarme prøverne fra 55 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller med dataindsamling. Standardindstillingen smelte-kurveanalyse for MyIQ (Bio-Rad) instrument er følgende: 95 ° C i 1 minut, 55 ° C i 1 minut, efterfulgt af 81 cykler af 10 sekunder ved indstillingspunkt 55 ° C, smelter kurve, + temp 0,5 ° C (kamera indsamler data på hver cyklus).
- Siden smeltetemperatur (Tm) af dsDNA er afhængig amplikon længde og GC-indhold, vil forskellige ampliconer have forskellige Tm (s). Undersøge afledte smeltekurver af qPCR produkterne for at bekræfte den specifikke smeltetemperatur ønskede amplikoner samt manglen på støj amplicon toppe (figur 2B).
- Forbered dobbelt eller tredobbelt reaktioner for hver analyse for statistisk analyse. Omfatter negative kontroller for QRT-PCR, såsom RT (-)-qPCR (qPCR med RNA som template uden revers transkription) og qPCR uden cDNA, RNA eller DNA-kilde tilsættes i PCR-blandingen. RT (-)-qPCR kan tjene som kontrol for mulige genomisk DNA-kontaminering (RT (-) i figur 2 og 3).
- Analyser qPCR data med IQ5 Optical System Software Version 2,0 (Bio-Rad). Normalisere udtrykket værdier H1 isoform gener med ekspressionen af housekeeping-genet (f.eks GAPDH, ß-actin, HPRT) til opnåelse af relative ekspressionsniveauer af H1 gener.
* Alle procedurer bør udføres på is eller ved 4 ° C.
- Dissekere musevæv og skyl det med iskold PBS. (Hvis der ikke fortsætte til ekstraktion med det samme, snap nedfrysning og opbevaring af prøver som beskrevet i trin 1.2.) Hakkekød vævet i stykker med barberblad. Overførsel hakke en Dounce homogenisator (B støder). Der tilsættes 10 ml saccharose buffer (0,3 M saccharose, 15 mM NaCI, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet tilsættes frisk) per gram væv. Homogenisere vævet med 10-15 slag.
- Overfør homogenater til et 15 ml rør, centrifugering ved 500 opm i 30 sekunder (centrifuge model: Eppendorf 5810R) forsigtigt overføre supernatanten til et nyt rør (kassere pellet-vævsrester) og centrifugeres ved 2000 rpm i 5 minutter, for at pelletere cellerne. Fortsæt til trin 3,4.
- Hvis histoner og chromatin skal ekstraheres fra celler dyrket i monolag, skylmed PBS tilsættes PBS til dyrkningsskålen, og høste cellerne under anvendelse celleskraber og pelletere cellerne ved centrifugering. For celler dyrket i suspension, celler pellet ved centrifugering.
- Resuspenderes cellebundfaldet i 10 ml saccharose buffer suppleret med 0,5% NP-40 (pr. gram udgangsvæv mængde eller 10 (8) celler). Overfører prøven til en Dounce homogenisator (B pistil) og Dounce 10 slag i løbet af 20 minutters inkubation. På dette punkt er nuclei opnået. Undersøg kerner kvalitet under et mikroskop. Pelletere kernerne ved centrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter. Supernatanten.
- Resuspendere kernerne pelleten i 3 ml højsaltpuffer (0,35 M KCI, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF - tilføre frisk før hver brug) pr 1 g væv eller 10 (8) celler. Overfører prøven til et lille Dounce homogenisator (B pistil) og homogeniseres med 5-10 slag.
- Aliquot af suspensionen i 3 Eppendorf-rør (1 ml hver), inkuberes på is i 20 minutter, efterfulgt afcentrifugering ved 14.000 rpm i 10 minutter for at pelletere kromatin. Supernatanten.
- Tilsættes 0,8 ml 0,2 NH2 SO4 hver kromatin pellet. Anvende en Eppendorf-rør støder dounce at formale pelleten godt, indtil pelleten er fuldstændig dissocieret. Inkuber prøverne på en roterende platform ved 4 ° C natten over. Samlede histoner ekstraheres med dette trin af syrebehandling.
- Centrifugeres ved 14.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten overføres (histon ekstrakter) i to Eppendorf-rør (400 gl / rør). Kassér pellet. Tilsæt 2,5 rumfang (1 ml) af iskold ethanol til hvert rør .. Holde prøverne ved -20 ° C natten over.
- Centrifugeres ved 14.000 rpm i 10 minutter for at pelletere alt histoner, supernatanten. Vask pellet tre gange med 70% EtOH, orlov på bænk i 20-30 minutter for at lufttørre. Lagring af de tørrede proteiner ved -80 ° C eller opløse dem i ddH2O og fortsætte til HPLC-analyse med det samme. Tørrede proteiner kan lagresved -80 ° C i op til 1 år.
4. HPLC-analyse af Linker Histoner
- Resuspender histon pelleten i den anbefalede mængde ddH2O afhængigt af kapaciteten af revers-fase-søjle og HPLC instrument. Vi anvender C18 revers fase kolonne 250 x 4,6 mm (Vydac), og Äktapurifier UPC 900 instrument (GE sundhedspleje) til HPLC-analyse. Vi typisk opløse 50 100 ug af total histoner i 100 pi af Ddh 2 0 til analyse.
- Centrifugeres ved 14.000 rpm i 5 minutter for at fjerne uopløselige rester. Bradford-proteinassay anvendes til at bestemme mængden af protein, der skal injiceres på søjlen. Injicer 50-100 mg totalt protein i omvendt fase kolonne ved HPLC-system. Lastning en overskydende mængde af protein bør undgås for at forhindre tilstopning af kolonnen.
- Fraktionere linker histoner og kerne histoner med en stigende acetonitrilgradient som anført i tabel 2.
Tabel 2 nedenfor. Stigende acetonitril gradient over tid.
- Effluenten kontrolleres ved 214 nm, og HPLC profiler (FiguAd 4) registreres og analyseres ved hjælp af Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) med UNICORN 5,11 software (GE Healthcare). De proteinfraktioner kan også indsamles i fraktion auto-kollektor (Frac-920 - GE) til yderligere analyse, fx SDS-PAGE og massespektrometri.
- A 214 værdierne af toppene af hver H1 undertype og H2B normaliseres med antallet af peptidbindinger i hver tilsvarende histon-protein. Den relative andel af de individuelle H1 histon undertyper i H1 familien, såvel som forholdet mellem H1 undertype til nukleosom kernepartikler kan beregnes ud fra disse normaliseret et 214-værdier (fig. 5).
5. Repræsentative resultater
Listen over mammale H1 undertype, samlet rutediagrammet og repræsentative resultater af ekspressionen analyse af individuelle histon H1-gener er vist i tabel 1, figur 1 og figur 2-5, henholdsvis.Figur 2A viser typiske amplifikationsprodukter kurver for H1A qPCR reaktioner under anvendelse af cDNA fremstillet ud fra muselever og mESCs, mens figur 2B viser de afledte smeltekurver af de tilsvarende amplikoner. Smeltekurven viser en enkelt karakteristisk top ved smeltetemperaturen (Tm) ved 86 ° C for H1A PCR-amplikon, og mangler ikke-specifik baggrund toppe, hvilket tyder på høj specificitet H1A qPCR assay. Evaluering af amplifikation plot (fig. 2A) viser, at de tredobbelte qPCR reaktioner hver prøve gav kraftige signaler med næsten identiske Ct-værdier, hvilket tyder på høj reproducerbarhed. Den manglende amplikoner opbygning fra RT (-)-qPCR reaktioner viser, at genomisk DNA-kontaminering ikke var til stede, eller minimal. Anvendelse af de Ct-værdier på H1 gener og husholdning gener, såsom GAPDH, blev de relative RNA ekspressionsniveauerne af hver H1-genet beregnes. Eksempler på beregnede resultater for H1 ° og H1A gener er vist i Forskellen i ekspressionen af H1A og H1 ° mESC versus voksen muselever fremgår også HPLC profiler af histon proteiner (figur 4). H1 °, differentieringen specifikke H1 er akkumuleret en stor mængde i modne væv, hvilket svarer til 27,2% af den samlede H1 i voksne lever (figur 5A). I modsætning hertil er H1 ° protein næsten fraværende i udifferentierede mESCs (figur 4B). På den anden side er H1A stærkt udtrykt i både mRNA-transkripter og proteiner, i mESCs (figur 3 & 4B). Gennem kvantificering af H1 toppe i HPLC-profil, er den relative andel af hver enkelt H1 undertype i H1 familien bestemt (fig. 5A). Desuden er værdien af individuelle H1 undertype (ellertotal H1) pr nukleosom kan beregnes som forholdet af den normaliserede A 214 topværdi af tilsvarende H1 undertype (eller summen af den samlede H1) til halvdelen af den normaliserede et 214 værdier for H2B (figur 5B). 
Figur 1. Samlet ordning udtryk analyse af pattedyr linker-histon-undertyper. 
Figur 2. Repræsentative resultater af H1A qPCR assay. (A) Amplificering afbildning af H1A qPCR assay. Tærsklen linje og Ct-værdier, som det IQ5 Optical System Software er angivet. (B) Afledte smelte-kurver qPCR produkter er vist i (A). 
Figur 3. QRT-PCR-analyse af mRNA-niveauer af H1A og H1 ° i mESCs og voksne mOuse leveren. Y-aksen repræsenterer de relative ekspressionsniveauer af H1 gener til den for reference-genet GAPDH. qPCR med RT (-) Prøverne (RNA uden revers transkription) viser minimal eller ingen signaler. 
Figur 4. HPLC-analyse af histoner ekstraheret fra pattedyrceller. Revers-fase HPLC-analyse af 100 pg totalt histoner ekstraheret fra voksne muselever (A) og muse ESC (B). X-akse: elueringstid. Y-akse: mAU, milli-absorptionsegenskaber enheder. 
Figur 5. H1 undertype sammensætning og H1 pr nukleosom nøgletal i voksne mus leveren. A 214 værdier toparealet for hver H1 isoform og H2B beregnes ved UNICORN 5,11 software (GE Healthcare) og normaliseret med antallet af peptidbindinger til stede i den tilsvarende histon-protein. Summen af normaliserede A214 værdier for alle H1 undertype opnås som det totale H1. Den procentdel af den totale H1 for hver H1 undertype (A) såvel som forholdet mellem H1 nukleosom (ved halvdelen af den normaliserede et 214 værdier H2B) (B) i voksne muselever beregnes ud fra HPLC viste profilen i figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sættet af assays præsenteret her muliggøre omfattende analyse af ekspressionsniveauerne af mammale linker histon undertyper. Korrekt udformet QRT-PCR assays tilvejebringe meget følsomme og nøjagtige målinger af RNA meddelelser fra alle pattedyr histon H1 gener. Den kritiske del af QRT-PCR assays til linkergrupper histon subtype gener er fremstillingen af cDNA under anvendelse af vilkårlig primer baseret revers transkription. mRNA mest histon gener, herunder de fleste H1 gener, som ikke indeholder en lang poly-A hale præsenteret i andre cellulære mRNA'er. Således traditionelle revers transkription-metoden med oligo-dT-primere, vil ikke effektivt at producere H1 cDNA'er. Ekspression analyse af de få H1 gener med mRNA-transkripter indeholdende poly-A-haler, såsom H1 0, er lige så effektiv med tilfældige hexamerer baseret QRT-PCR (figur 3), sandsynligvis på grund af den høje forekomst af H1 RNA'er. Ikke desto mindre en blanding af oligo-dT-primere og tilfældige hexamerer til RT reaktiontion kan tilpasses til at forbedre RT effektiviteten af polyadenylerede mRNA'er, der har lavt kopiantal, tillader bredere dækning af gener analyseret ved QRT-PCR. QRT-PCR af interne referenceformål gener, såsom rengøring gen GAPDH, er inkluderet således, at den relative ekspression niveauet af specifikke H1 gener tværs væv eller celletyper kan sammenlignes (figur 3). Ved at kombinere QRT-PCR med standardkurve analyse er det også muligt at opnå absolutte kopiantal af H1 cDNA'er fra forskellige prøver (data ikke vist).
Her har vi også beskrive protokoller til histon ekstraktion og HPLC-analyse af histon proteiner. Fordelen ved denne metode er, at man kan bestemme de relative andele af hver H1 undertype i pulje af totale H1 proteiner såvel som kvantificere forholdet individuelle H1 undertype (og i alt H1) pr nukleosom. I forhold til andre protein analysemetoder, såsom Western blotting, HPLC-analyse proVides mere kvantitative og reproducerbare målinger af alle H1 undertyper. De forskellige niveauer og sammensætning af H1 undertype i cellen modulere højere orden kromatin. Forholdet mellem H1 nukleosom har vist sig at korrelere med chromatin komprimering og er en determinant for nukleosom repeat længde i kromatin 2. Derfor bør de metoder, vi her beskrevne har brede anvendelser i kromatin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud GM085261 og Georgien Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (til YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
