Summary
نحن وصف مجموعة من فحوصات لتحليل مستويات التعبير من histones رابط H1. يتم قياسها كميا مرنا من الجينات H1 الفردية العشوائية النسخ العكسي التمهيدي استنادا تليها في الوقت الحقيقي PCR، في حين يتم تحقيق الكمي من البروتين histones H1 بواسطة تحليل HPLC.
Abstract
H1 هيستون رابط بربط الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات والحمض النووي رابط، وتسهيل للطي من لونين إلى أعلى هيكل النظام. H1 أمر أساسي للتنمية الثدييات (1) وينظم محددة التعبير الجيني في الجسم الحي 2-4. بين البروتينات هيستون حفظا للغاية، والأسرة من histones رابط H1 هي مجموعة غير متجانسة أكثر. وهناك أنواع فرعية H1 11 في الثدييات التي تنظم بشكل مختلف خلال التنمية وأنواع مختلفة من الخلايا. هذه الأنواع الفرعية H1 منها 5 جسدية H1S (H1A الإلكترونية)، واستبدال H1 0، 4 جرثومة فرعية الخلية H1 محددة، وH1x 5. وجود أنواع فرعية H1 المتعددة التي تختلف في تقارب الحمض النووي ملزم لونين وقدرة الضغط 6-9 توفر مستوى إضافي من تعديل وظيفة من لونين. وبالتالي، التحليل الكمي التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية، وكلاهما من مرنا والبروتينات، أمر ضروري لفهم أفضل للتنظيم العاليترتيب هيكل لونين وظيفة.
نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات تهدف لتحليل مستويات التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية (الشكل 1). ويتم قياس التعبير مرنا من مختلف الجينات البديل H1 من قبل مجموعة من حساسة للغاية وكمية النسخ المقايسات-PCR (qRT-PCR) العكسي، والتي هي أسرع وأكثر دقة وتتطلب عينات أقل بكثير بالمقارنة مع نهج بديل من تحليل لطخة الشمالية. وخلافا لمعظم غيرها من الرسائل الخلوية مرنا، mRNAs للجينات معظم هيستون، بما في ذلك غالبية الجينات H1، تفتقر إلى ذيل polyA طويل، ولكنها تحتوي على بنية الجذعية حلقة في المنطقة 3 'غير مترجمة (UTR) 10. لذلك، يتم إعداد cDNAs من مجموع بواسطة الحمض النووي الريبي النسخ العكسي باستخدام البادئات العشوائية بدلا من بنسبة ضئيلة من DT الاشعال. وتجرى فحوصات PCR الوقت الحقيقي مع الاشعال الخاصة بكل أنواع فرعية H1 (الجدول 1) للحصول على القياس الكمي للغاية من مستويات مرنا من النوع الفرعي H1 الفرديةق. ويتم تحليل التعبير عن الجينات التدبير المنزلي وضوابط للتطبيع.
يتم الحصول على الوفرة النسبية للبروتينات من كل سلالة H1 و histones الأساسية من خلال عكس اللوني المرحلة السائلة عالية الأداء (RP-HPLC) تحليل histones مجموع المستخرج من خلايا الثدييات 11-13. ووصف طريقة HPLC وشروط منح شطف هنا فصل الأمثل من أنواع فرعية H1 الماوس. عن طريق قياس الشخصية HPLC، قمنا بحساب الحصة النسبية من أنواع فرعية H1 الفردية داخل الأسرة H1، وكذلك تحديد من H1 إلى نسبة النيوكليوسومات في الخلايا.
Protocol
1. إعداد العينات واستخلاص الحمض النووي الريبي
- قبل استخراج الحمض النووي الريبي، ينبغي أن تزول جميع أسطح العمل والماصات مع الايثانول 70٪ وتعامل مع حل تطهير ريبونوكلياز، مثل زاب ريبونوكلياز. هذه الممارسة يقلل من فرص التلوث والتدهور ريبونوكلياز الحمض النووي الريبي. ارتداء القفازات لجميع الإجراءات.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة الماوس، وتشريح الجهاز من الاهتمام من الماوس الموت الرحيم، وغسل الفوسفات في الأنسجة الجليد الباردة مخزنة المالحة (بى بى سى: 0.13 م كلوريد الصوديوم، و 5 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ملي heptahydrate، 5 مم فوسفات هيدروجين الصوديوم heptahydrate، ودرجة الحموضة 7.4) . الشروع فورا في الجيش الملكي النيبالي استخراج في الخطوة 1.4. إذا أنسجة جديدة لا يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي، ينبغي أن عينات الأنسجة يكون الخاطف مجمدة في النيتروجين السائل على الفور، ويتم تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- إذا RNA هو ان يكون استخراجه من خلية ثقافة ملتصقة، نضح وسائل الإعلام والثقافة، وشطف مع كمية كافية من برنامج تلفزيوني، وإضافة الكاشف Trizol (خارج الجسمجنرال) على لوحة وانتقل إلى الخطوة 1.4. للخلايا المزروعة في التعليق، وحصاد الخلايا والخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي. تجاهل وسائل الإعلام، شطف الكريات لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني، وبيليه الخلايا مع الطرد المركزي. إضافة الكاشف Trizol وانتقل إلى الخطوة 1.4.
- يكفي الكاشف Trizol ضروري للحصول على الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية. استخدم 1 مل الكاشف Trizol لاستخراج الحمض النووي الريبي 50-100 ملغ الأنسجة، 5 - 10 × 10 6 خلايا (للثقافات تعليق) أو في لوحة سم 3.5 (للثقافات ملتصقة). تجانس الأنسجة في الكاشف Trizol مع Polytron PT2100 الخالط (أو ما يعادله). والمضي قدما لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة أو الخلايا وفقا لدليل الشركة المصنعة لالكاشف Trizol (إينفيتروجن).
- ويتم قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام Nanodrop 1000 (الحرارية العلمية)، ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الجودة من خلال هلام إستشراد. ويتراوح العائد نموذجي من 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل ملغ من الأنسجة أو 5-15 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في الخلايا 1 س 6 10 مثقف. للقضاء علىتلوث محتمل من الحمض النووي الريبي من كمية ضئيلة من الحمض النووي الجيني، يتم التعامل مع عينات من الحمض النووي الريبي مع ريبونوكلياز خالية الدناز (سيغما AMP-D1) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. كرر تقرير الحمض النووي الريبي وتركيز الكهربائي للهلام لضمان عدم تدهور الحمض النووي الريبي من هذا العلاج. استخراج الحمض النووي الريبي في مخزن -80 درجة مئوية.
* ملاحظة: يمكن أيضا الحمض النووي الريبي يمكن استخراجها باستخدام عدة RNAeasy (QIAGEN) وفقا لدليل عدة، أو عن طريق الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مجموعة (QIAGEN) وإذا رغبت كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
2. كمي عكس النسخ PCR (qRT-PCR)
- وكتب عكس مجموع الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام نظام الثالث مرتفع التوليفي الأول حبلا (إينفيتروجن). منذ مرنا من الجينات معظم H1 تفتقر بولي-A-ذيول، من المهم جدا لاستخدام hexamers عشوائي بدلا من بنسبة ضئيلة من DT كما الاشعال لتخليق [كدنا]. ومع ذلك، إذا كان المطلوب أيضا تحليل التعبير عن الجينات مع رسائل مذيل بعديد الأدينيلات عند مستويات منخفضة، وهي مزيج من hexamers العشوائية وشو بنسبة ضئيلة من DTيمكن استخدام LD في رد الفعل العكسي (RT) النسخ لتحسين كفاءة النسخ العكسي من mRNAs مذيل بعديد الأدينيلات.
- تنفيذ رد فعل RT وفقا لدليل الشركة المصنعة. لفترة وجيزة،
- في أنبوب 0،5 مل PCR، والجمع بين 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، 1 ميكرولتر من hexamers 50 عشوائي نانوغرام / ميكروليتر، 1 ميكرولتر من 10 ملي dNTP المزيج، وإضافة DEPC المعالجة H 2 O لجعل حجم رد الفعل الكلي إلى 10 ميكروليتر. تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، تليها حضانة 1 دقيقة على الجليد.
- إعداد 10 ميكرولتر من مزيج التجميعي [كدنا]: 2 ميكرولتر من العازلة 10xRT، 4 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2، 2 ميكرولتر من DTT 0.1M، 1 ميكرولتر من RNaseOut (40 U / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر من مرتفع الثالث RT (200 U / ميكرولتر) وإضافته إلى خليط الجيش الملكي النيبالي / التمهيدي.
- احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 25 مئوية، تليها 50 دقيقة على 50 درجة مئوية وإنهاء رد فعل على 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- كل رد فعل ينتج عادة 100-250 نانوغرام / ميكروليتر من الناتج [كدنا]. تخزين المنتجات [كدنا] في -20درجة مئوية أو الشروع فورا عن PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR).
- يمكن qPCR تحديد دقيق لنسخ تسلسل الهدف بكفاءة عالية واستنساخ 14. اختر قياس qPCR نحن من قبل SYBR الأخضر صبغ، والذي يعطي إشارة فلوري فقط عندما intercalates مع المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA). وإن لم تكن محددة مثل فحص Taqman 14، هذا الأسلوب هو أكثر فعالية من حيث التكلفة وأسهل التي يتعين اتخاذها في المختبر، ويعطي المزيد من التنوع إلى qPCR. ولذلك، فمن المهم للنظر في مؤامرة التضخيم (الشكل 2A) ومنحنيات الذوبان مشتق من المنتج qPCR (الشكل 2B) لضمان كفاءة ونوعية رد فعل.
| هيستون فرعية | التسميات الماوس هيستون | هيستون تسمية الإنسان | ||
| جنرال الكتريكNE اسم | لا الانضمام. | الجين اسم | لا الانضمام. | |
| هيستون H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| هيستون H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| هيستون H1C | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| هيستون H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| هيستون H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| H1 هيستون ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| هيستون H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| هيستون H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| هيستون H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| هيستون H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| هيستون Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
الجدول رقم 1. هيستون تسمية النوع الفرعي H1 في الماوس والبشرية.
- تصميم إلى الأمام وعكس الاشعال PCR محددة لكل جينة H1 (الجدول 1). نظرا لتشابه تسلسل عالية بين H1S الجسدية، ولا سيما في المنطقة المقابلة لنطاق كروي مركزي، من المهم جدا للتأكد من أن الاشعال مصممة لنوع فرعي H1 محددة لا تتماشى مع سذر جينات H1، أو عبر تضخيم H1 فرعية أخرى. من المهم أيضا أن نلاحظ أن معظم الجينات H1 لا تحتوي على الإنترونات. وهكذا، تمتد الإنترون الاشعال اعتمدت عادة لRT-PCR لتجنب التلوث الجيني ليست متاحة. بدلا من ذلك، ينبغي أن عينات الحمض النووي الريبي معالجة مسبقة مع الدناز (انظر 1.5) للقضاء على أي كمية ضئيلة من التلوث الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، RT - ينبغي أن يقوم، في qPCR مواز للتحقق من صحة عدم وجود تلوث الجيني في العينات [كدنا] ().
- الاشعال تصميم أيضا للجينات المرجعية الداخلية، التي لا يتم تغيير التعبير بين العينات. غالبا ما يتم اختيار الجينات التدبير المنزلي، مثل غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة (GAPDH) والجينات بيتا الأكتين، كما جينات مرجعية. إشارات qPCR من الجينات التدبير المنزلي بمثابة الضوابط التطبيع.
- إعداد كل رد فعل PCR (إجمالي حجم 25 ميكرولتر) على النحو التالي: 12.5 ميكرولتر من الذكاء 2X Supermix الأخضر SYBR (بيو راد) (dNTPs تحتوي على، 50 الحمض النووي iTaq يو / مل بوليميريز، 6 مم MgCl 2، SYBR أنا الأخضر و 20فلوريسئين نانومتر)، 2 ميكروليتر من 4 ميكرولتر 1،25 نانوغرام / ميكروليتر [كدنا]، من 10 نانومتر إلى الأمام / مزيج التمهيدي العكسي، و9.25 ميكرولتر من DDH 2 O، وتخلط جيدا في Microseal 96-جيدا لوحة PCR. استخدام الأختام 'ب' Microseal لاصق (بيو راد) لضمان أن يتم إغلاق الغطاء لوحة الى لوحة. اضغط لفترة وجيزة أو دوامة لوحة PCR، وتدور باستمرار على مخاليط رد فعل من جانب الطرد المركزي قصير. وضع لوحة واحدة في MyIQ اللون في الوقت الحقيقي ونظام لكشف PCR (بيو راد) لqPCR.
- نحن نستخدم الظروف qPCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. دراسة منحنيات التضخيم (الشكل 2A) لتحقيق الكفاءة PCR والتصوير المقطعي (عتبة دورة) القيم. ويمكن خط عتبة تعيين تلقائيا من قبل IQ5 بصري 2.0 إصدار نظام برمجيات.
- ويمكن اختبار كفاءة التمهيدي وتركيز [كدنا] المثلى التي يحتاجها فحص منحنى القياسية، وفيه تخفيف من مسلسل الحمض النووي الجيني أنايتم رسم الصورة المستخدمة لqPCR والقيم ط م ضد سجل من كمية الحمض النووي القالب. ومن شأن فحص qPCR الأمثل مع الاشعال من الدقة والكفاءة العالية تعطي منحنى خطي مستوى، مع معامل التحديد (R 2)> 0.98. تجنب الاشعال مع طول amplicon أطول من 200 شركة بريتيش بتروليوم، والتي تميل إلى أن تكون فقيرة كفاءة التضخيم.
- لأن SYBR الأخضر بالكشف عن أي dsDNA، فإن من الأهمية بمكان لتنفيذ سلسلة منحنى ذوبان في أعقاب qPCR للتأكد من أن amplicon المطلوب، ولكن يتم تضخيم dimers التمهيدي أو ليس من الملوثات، والكشف عنها. للذوبان منحنى برنامج، وتحليل الصك qPCR لتسخين عينات من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية في 0.5 درجة مئوية مع الزيادات جمع البيانات. الإعداد الافتراضي للذوبان منحنى تحليل لMyIQ (بيو راد) صك هو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها بنسبة 81 دورات من 10 ثانية في setpoint 55 درجة مئوية، تذوب منحنى، + درجة الحرارة 0.5 درجة مئوية (كاميرا بجمع البيانات في كل دورة).
- منذ درجة حرارة انصهار (TM) من dsDNA يعتمد على طول amplicon والمحتوى GC، سوف amplicons المختلفة لها تيم مختلفة (ق). دراسة منحنيات ذوبان مشتق من المنتجات qPCR للتأكد من درجة حرارة انصهار محددة من amplicons المطلوب، فضلا عن عدم وجود قمم amplicon الضوضاء (الشكل 2B).
- إعداد ثلاث نسخ مكررة أو ردود الأفعال لكل فحص للتحليل الإحصائي. وتشمل الضوابط سلبية على qRT-PCR، مثل RT (-)-qPCR (qPCR مع RNA كقالب دون النسخ العكسي) وqPCR مع عدم وجود الحمض النووي الريبي، [كدنا] أو الحمض النووي أضاف المصدر في مزيج PCR. RT (-) يمكن أن تكون بمثابة-qPCR السيطرة على تلوث محتمل الحمض النووي الجيني (RT (-) في الشكل رقم 2 و 3).
- تحليل البيانات مع qPCR IQ5 بصري نظام برامج الإصدار 2.0 (بيو راد). تطبيع قيم التعبير عن الجينات شكل الإسوي H1 مع التعبير عن الجينات التدبير المنزلي (على سبيل المثال GAPDH، SS-الأكتين، HPRT) للحصول على مستويات التعبير النسبية للجينات H1.
* ينبغي تنفيذ كافة الإجراءات على الجليد أو في درجة مئوية 4
- تشريح الأنسجة الماوس وشطفه مع الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني. (إذا لم تشرع في استخراج فورا، المفاجئة تجميد وتخزين عينات كما هو موضح في الخطوة 1.2.) اللحم المفروم النسيج الى قطع مع شفرة حلاقة. نقل اللحم المفروم إلى الخالط Dounce (B مدقة). إضافة 10 مل الواق السكروز (0.3 السكروز م، 15 مم كلوريد الصوديوم، HEPES 10 ملم [درجة الحموضة 7،9]، 2 مم EDTA، 0.5 مم PMSF، كاملة مثبط للبروتياز البسيطة وحي كوكتيل، إضافة الطازجة) لكل غرام من النسيج. تجانس الأنسجة مع 10-15 السكتات الدماغية.
- نقل الخليط إلى أنبوب 15 مل، وتدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (نموذج أجهزة الطرد المركزي: إيبندورف 5810R)؛ نقل بعناية وطاف على أنبوب جديد (تجاهل الحطام بيليه النسيج)، وأجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، إلى خلايا بيليه. انتقل إلى الخطوة 3.4.
- إذا histones لونين وسيتم استخراجها من الخلايا التي تزرع في أحادي الطبقة، شطفمع برنامج تلفزيوني، إضافة إلى برنامج تلفزيوني على طبق والثقافة، وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية، وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي. للخلايا المزروعة في التعليق، وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي.
- Resuspend وبيليه الخلية في 10 مل الواق السكروز تستكمل مع 0.5٪ NP-40 (في بداية غرام كمية الأنسجة أو 10 (8) خلايا). نقل العينة إلى الخالط Dounce (B مدقة) والسكتات الدماغية في غضون 10 dounce حضانة 20 دقيقة. عند هذه النقطة، ويتم الحصول على النوى. فحص جودة نوى تحت المجهر. بيليه نوى بواسطة الطرد المركزي عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
- Resuspend وكريات النوى في 3 مل مخزن الملح (0.35 م بوكل، تريس 10 ملم [درجة الحموضة 7،2]، 5 مم MgCl 2، 0.5 مم PMSF - إضافة جديدة قبل كل استعمال) في 1 غرام من النسيج أو 10 (8) خلايا. نقل العينة إلى الخالط Dounce الصغيرة (B مدقة) والتجانس مع السكتات الدماغية 5-10.
- قسامة تعليق في أنابيب إيبندورف 3 (1 مل لكل منهما)، احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة، تليهاالطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لونين بيليه. تجاهل طاف.
- إضافة 0.8 مل 0،2 NH 2 SO 4 إلى كل بيليه لونين. استخدام dounce إيبندورف مدقة أنبوب لطحن بيليه جيدا حتى بيليه هو فصلها تماما. احتضان هذه العينات على منصة دوارة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يتم استخراج histones التام مع هذه الخطوة من العلاج حامض.
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. نقل وطاف (مقتطفات هيستون) في أنابيب إيبندورف 2 (400 ميكروليتر / أنبوب). تجاهل بيليه. إضافة 2،5 مجلدات (1 مل) من الايثانول الجليد الباردة إلى كل أنبوب .. الحفاظ على العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية خلال الليل.
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق إلى histones مجموع بيليه، تجاهل طاف. يغسل ثلاث مرات بيليه مع EtOH 70٪، وترك على مقاعد البدلاء لمدة 20-30 دقيقة على الهواء الجاف. تخزين البروتينات المجففة في -80 درجة مئوية أو حل لهم في DDH 2 O، والشروع في تحليل HPLC فورا. ويمكن تخزين البروتينات المجففةفي -80 درجة مئوية لمدة تصل الى 1 سنة.
4. HPLC تحليل Histones رابط
- Resuspend وبيليه هيستون في حجم الموصى بها من DDH 2 O اعتمادا على قدرة عكس المرحلة عمود والصك HPLC. نحن نستخدم C18 عمود مرحلة العكسي 250 × 4.6 ملم (Vydac)، واتحاد الوطنيين الكونغوليين Äktapurifier 900 صك (GE للرعاية الصحية) للتحليل HPLC. نحن عادة ما حل 50-100μg من مجموع histones في 100 ميكروليتر من DDH 2 0 لتحليلها.
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لإزالة المخلفات غير القابلة للذوبان. ويستخدم برادفورد فحص البروتين لتحديد كمية البروتين ليتم حقنه على العمود. حقن 50-100 ميكروغرام من البروتين الكلي في العمود مرحلة العكسي على نظام HPLC. وينبغي تجنب تحميل لكميات زائدة من البروتين لمنع انسداد العمود.
- يجزئ في histones رابط وhistones الأساسية مع التدرج الأسيتونيتريل متزايد على النحو الوارد في الجدول رقم 2.
الجدول 2. زيادة التدرج الأسيتونيتريل مع مرور الوقت.
- ويتم رصد النفايات السائلة في 214 نانومتر، وملامح HPLC (فيقووتسجل إعادة 4) وتحليلها باستخدام Äktapurifier UPC 900 (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) مع UNICORN 5،11 برنامج (GE للرعاية الصحية). ويمكن للبروتين الكسور التي جمعت أيضا مع جزء لصناعة السيارات في جامع (فارك-920 - GE) لمزيد من التحليل، مثل قياس الطيف SDS-PAGE والشامل.
- وتطبيع قيم 214 من القمم من كل سلالة H1 و H2B من قبل عدد من السندات الببتيد من البروتين كل هيستون المقابلة. ويمكن حساب الحصة النسبية من أنواع فرعية H1 فرد هيستون H1 داخل الأسرة، فضلا عن نسبة من الأنواع الفرعية H1 إلى الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات من هذه تطبيع قيم 214 (الشكل 5).
5. ممثل النتائج
وتظهر قائمة فرعية H1 الثدييات، ومخطط شامل والنتائج ممثل تحليل التعبير عن الجينات الفردية H1 هيستون في الجدول 1، الشكل 1 والشكل 2-5، على التوالي.2A يوضح الشكل منحنيات التضخيم نموذجية من ردود الفعل qPCR H1A باستخدام [كدنا] أعدت من كبد الفأر وmESCs، في حين أن الشكل 2B يبين منحنيات ذوبان مشتق من amplicons المقابلة. منحنى ذوبان يعرض ذروة واحدة مميزة في درجة حرارة انصهار (TM) في 86 درجة مئوية لamplicon PCR H1A، ويفتقر إلى قمم خلفية غير محددة، مما يشير إلى النوعية العالية للفحص qPCR H1A. تقييم مؤامرة التضخيم (الشكل 2A) يدل على أن ردود الفعل qPCR ثلاث نسخ من كل عينة اعطت اشارات تتفق مع قيم ط م متطابقة تقريبا، مما يشير إلى استنساخ عالية. عدم وجود amplicons تراكم من RT (-)-qPCR ردود فعل تشير إلى أن التلوث الجيني DNA لم يكن موجودا، أو الحد الأدنى. الاستفادة من القيم ط م من الجينات H1 والجينات التدبير المنزلي، مثل GAPDH، وحسبت تعبير الحمض النووي الريبي النسبي مستويات كل جينة H1. وترد أمثلة على النتائج المحسوبة لدرجة H1 والجينات في H1A الفرق في التعبير عن H1A أو درجة H1 في كبد فأر مسك مقابل البالغين واضح أيضا من ملامح HPLC من البروتينات هيستون (الشكل 4). وتراكمت H1 °، H1 تمايز معين، إلى كمية كبيرة في الأنسجة الناضجة، وهو ما يمثل 27.2٪ من مجموع H1 في كبد الكبار (الشكل 5A). في المقابل، H1 ° بروتين غير موجودة تقريبا في mESCs غير متمايز (الشكل 4B). من ناحية أخرى، يتم التعبير عن درجة عالية H1A، على حد سواء في محاضر مرنا والبروتينات، في mESCs (الشكل 3 و 4B). من خلال القياس الكمي للقمم H1 في الملف HPLC، يتم تحديد الحصة النسبية من النوع الفرعي H1 كل فرد داخل الأسرة H1 (الشكل 5A). وعلاوة على ذلك، فإن القيم من النوع الفرعي H1 الفردية (أوويمكن حساب مجموع H1) في النيوكليوسومات من قبل نسبة من ألف لتطبيع قيمة الذروة 214 من الأنواع الفرعية H1 المقابلة (أو مجموع H1 الكل) إلى نصف واحد من تطبيع والقيم 214 لH2B (الشكل 5B). 
الشكل 1. الخطة الشاملة للتحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات. 
الشكل 2. نتائج الممثل من فحص qPCR H1A. (أ) مؤامرة التضخيم من فحص qPCR H1A. يشار إلى خط العتبة والقيم ط م التي وضعتها برامج IQ5 النظام البصري. (ب) المشتق تذوب-المنحنيات من المنتجات qPCR هو مبين في (A). 
الشكل 3. qRT-PCR تحليل مستويات مرنا من H1A و° H1 في mESCs وم الكبار[أوس] الكبد. Y محور يمثل مستويات التعبير النسبية للجينات H1 إلى أن من GAPDH الجينات مرجع. qPCR مع RT (-) عينات (RNA بدون النسخ العكسي) ويظهر اشارات ضئيلة أو معدومة. 
تحليل شخصية HPLC 4. من histones المستخرج من خلايا الثدييات. العكسية مرحلة التحليل HPLC من مجموع 100 ميكروغرام histones المستخرج من كبد فأر بالغ (أ) والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (B). X محور: وقت شطف. Y محور: ماو، ملي الامتصاص وحدة. 
الشكل 5. H1 تكوين سلالة وH1 في نسب النيوكليوسومات في كبد فأر بالغ. يتم حساب قيم 214 من منطقة ذروة لكل شكل الإسوي H1 و H2B باستخدام UNICORN 5،11 برنامج (GE للرعاية الصحية)، وتطبيع من قبل عدد من السندات الببتيد موجودة في البروتين وهيستون المقابلة. مجموع تطبيع Aيتم الحصول على 214 قيم جميع أنواع فرعية H1 كقيمة لمجموع H1. النسبة المئوية للH1 الإجمالية لكل نوع فرعي H1 (A) وكذلك نسبة من H1 إلى النيوكليوسومات (يمثلها نصف واحد من تطبيع قيم 214 من H2B) (B) في كبد فأر بالغ وتحسب من التشكيل الجانبي HPLC هو مبين في الشكل 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدمت مجموعة من فحوصات هنا تمكين تحليل شامل لمستويات التعبير عن الأنواع الفرعية الثدييات هيستون رابط. صمم بشكل صحيح qRT-PCR المقايسات توفير قياسات حساسة للغاية ودقيقة من الرسائل من أي جينات الحمض النووي الريبي هيستون H1 الثدييات. وجزء هام من qRT-PCR المقايسات لرابط جينات سلالة هيستون هو إعداد [كدنا] باستخدام التمهيدي عشوائي استنادا النسخ العكسي. مرنا من الجينات معظم هيستون، بما في ذلك معظم جينات H1، لا تحتوي على فترة طويلة بولي ذيل المقدمة في mRNAs الخلوية الأخرى. وبالتالي فإن الطريقة التقليدية مع النسخ العكسي بنسبة ضئيلة من DT الاشعال لا تنتج بكفاءة cDNAs H1. تحليل التعبير عن الجينات H1 مع بعض النصوص التي تحتوي على مرنا بولي والذيول، مثل H1 0، غير فعالة على قدم المساواة مع hexamers عشوائي استنادا qRT-PCR (الشكل 3)، ربما بسبب وفرة عالية من RNAs H1. مع ذلك، وهي مزيج من بنسبة ضئيلة من DT الاشعال وhexamers عشوائي لراكوشبالوتاي RTويمكن اعتماد نشوئها لتحسين كفاءة RT mRNAs مذيل بعديد الأدينيلات التي هي من أعداد نسخة منخفضة، مما يتيح تغطية أوسع من الجينات التي حللها qRT-PCR. يتم تضمين qRT-PCR من الجينات المرجعية الداخلية، مثل التدبير المنزلي الجينات GAPDH، بحيث يمكن مقارنة مستوى التعبير النسبية للجينات H1 محددة عبر الأنسجة المختلفة أو أنواع الخلايا (الشكل 3). من خلال الجمع بين qRT-PCR مع تحليل منحنى قياسي، فإنه من الممكن أيضا الحصول على نسخة أرقام المطلقة للcDNAs H1 من عينات مختلفة (لا تظهر البيانات).
هنا نحن كذلك أن تصف بروتوكولات لاستخراج هيستون والتحليل HPLC من البروتينات هيستون. وميزة هذا الأسلوب هو أنه يمكن لأحد أن تحديد النسب النسبية لكل نوع فرعي H1 ضمن مجموعة من البروتينات H1 مجموع كذلك تحديد حجم ونسبة النوع الفرعي H1 الفردية (ومجموع H1) في النيوكليوسومات. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع غيرها من وسائل تحليل البروتين، مثل غرب النشاف، وتحليل HPLC المواليةفيديس أكثر القياسات الكمية واستنساخه من جميع الأنواع الفرعية H1. على مستويات مختلفة، وتكوين الأنواع الفرعية H1 في الخلية تعدل أعلى هيكل لونين النظام. وقد تبين أن نسبة من H1 إلى النيوكليوسومات لربط مع الضغط لونين وغير محددا لطول تكرار النيوكليوسومات في لونين 2. وبالتالي، ينبغي أن الأساليب التي وصفناها هنا أن تكون لها تطبيقات واسعة في مجال البحوث لونين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM085261 وسرطان جورجيا التحالف المتميز جائزة الباحث (إلى YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
