Summary
हम assays के एक सेट का वर्णन करने के लिए एच 1 linker histones की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण. व्यक्ति एच 1 जीन की mRNA मात्रात्मक यादृच्छिक प्राइमर आधारित रिवर्स वास्तविक समय पीसीआर के बाद प्रतिलेखन द्वारा मापा जाता है, जबकि एच 1 हिस्टोन प्रोटीन की मात्रा का ठहराव HPLC विश्लेषण द्वारा हासिल की है.
Protocol
1. नमूना तैयार करना और शाही सेना निष्कर्षण
- शाही सेना निष्कर्षण से पहले, सभी काम कर सतहों और pipettes 70% इथेनॉल के साथ साफ हो जाना चाहिए और RNase परिशोधन समाधान, के रूप में RNase जैप के साथ इलाज किया. इस अभ्यास RNase संदूषण और आरएनए गिरावट की संभावना कम कर देता है. सभी प्रक्रियाओं के लिए दस्ताने पहनें.
- माउस ऊतक से शाही सेना को निकालने के लिए, euthanized माउस से ब्याज का अंग काटना, और बर्फ के ठंडे फास्फेट में ऊतक धोने खारा बफर (पीबीएस: 0.13 एम NaCl, 5 मिमी सोडियम फास्फेट द्विबेसीय heptahydrate, 5 मिमी सोडियम dihydrogen फॉस्फेट heptahydrate, 7.4 पीएच) . तुरंत आगे बढ़ना 1.4 चरण में निष्कर्षण शाही सेना. यदि ताजा ऊतक शाही सेना निष्कर्षण के लिए संसाधित नहीं किया जा है, ऊतकों के नमूनों को तरल नाइट्रोजन में जमे हुए तस्वीर तुरंत हो सकता है और किया जाना चाहिए ° बाद में उपयोग के लिए सी -80 पर संग्रहीत.
- यदि शाही सेना के लिए पक्षपाती सेल संस्कृति से निकाला जा रहा है, संस्कृति मीडिया महाप्राण (व्यंजन), पीबीएस का पर्याप्त राशि के साथ कुल्ला, और Trizol अभिकर्मक (Invitroथाली पर) पीढ़ी और 1.4 कदम आगे बढ़ना. निलंबन में विकसित कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं और centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं फसल. मीडिया त्यागें, छर्रों पीबीएस के साथ संक्षिप्त कुल्ला, और centrifugation साथ कोशिकाओं गोली. Trizol अभिकर्मक जोड़ें और 1.4 कदम आगे बढ़ना.
- पर्याप्त Trizol अभिकर्मक उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. 1 मिलीलीटर Trizol अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए 50 से शाही सेना को निकालने के 100 मिलीग्राम ऊतक, 5 x 10 10 6 (निलंबन संस्कृतियों के लिए) कोशिकाओं या 3.5 सेमी प्लेट प्रति पक्षपाती संस्कृतियों के लिए. Polytron PT2100 homogenizer (या समतुल्य) के साथ Trizol अभिकर्मक में ऊतक Homogenize. ऊतकों के नमूनों या कोशिकाओं से शाही सेना Trizol अभिकर्मक के लिए निर्माता की पुस्तिका (Invitrogen) के अनुसार निकालने के लिए आगे बढ़ना.
- शाही सेना एकाग्रता Nanodrop (थर्मो वैज्ञानिक) 1000 और शाही सेना गुणवत्ता जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया जाता है का उपयोग कर मापा जाता है. ठेठ उपज या 1 एक्स 10 6 संवर्धित कोशिकाओं के प्रति शाही सेना के 5-15 μg ऊतक की मिलीग्राम प्रति शाही सेना में से 1-10 μg से पर्वतमाला. को खत्म करनेजीनोमिक डीएनए के निशान राशि से शाही सेना के संभावित संदूषण, शाही सेना के नमूने RNase मुक्त DNase (सिग्मा एएमपी - डी 1) के साथ निर्माता अनुदेश के अनुसार व्यवहार कर रहे हैं. इस उपचार से शाही सेना की कोई गिरावट सुनिश्चित शाही सेना एकाग्रता दृढ़ संकल्प और जेल वैद्युतकणसंचलन दोहराएँ. स्टोर -80 में शाही सेना निकाले डिग्री सेल्सियस
* नोट: शाही सेना भी किट पुस्तिका के अनुसार RNAeasy किट (क्विएज़न) का उपयोग कर निकाला जा सकता है, या डीएनए / आरएनए किट (क्विएज़न) द्वारा अगर दोनों डीएनए और आरएनए वांछित हैं.
2. मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (qRT-पीसीआर)
- कुल शाही सेना को रिवर्स सीडीएनए का उपयोग सुपरस्क्रिप्ट तृतीय पहली किनारा संश्लेषण सिस्टम (Invitrogen) में लिखित है. चूंकि अधिकांश एच 1 जीन की mRNA पाली - ए - पूंछ की कमी है, यह सीडीएनए संश्लेषण के लिए प्राइमरों के रूप में oligo-dt के बजाय यादृच्छिक hexamers का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, अगर polyadenylated संदेश के साथ निम्न स्तर पर जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण भी वांछित है, यादृच्छिक hexamers और shou oligo-dt का एक मिश्रणld रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) polyadenylated mRNAs की रिवर्स प्रतिलेखन दक्षता में सुधार की प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया जाएगा.
- निर्माता पुस्तिका के अनुसार आरटी प्रतिक्रिया प्रदर्शन. संक्षेप में,
- एक 0.5 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूब में कुल शाही सेना के 5 μg, 50 एनजी / μl यादृच्छिक hexamers 1 μl, 10 मिमी dNTP मिश्रण का 1 μl गठबंधन, और DEPC इलाज एच 2 हे जोड़ने के लिए कुल 10 μl के रूप में प्रतिक्रिया मात्रा. अच्छी तरह मिक्स और 65 में 5 मिनट के लिए सेते हैं ° सी, बर्फ पर 1 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा किया.
- सीडीएनए संश्लेषण मिक्स 10 μl तैयार: 2 10xRT बफर, 25 मिमी 4 μl μl 2 MgCl, 0.1M, डीटीटी, RNaseOut की 1 μl (40 यू / μl), में सुपरस्क्रिप्ट तृतीय आर टी (200 यू / 1 μl 2 μl μl) और यह / प्राइमर मिश्रण शाही सेना के लिए जोड़ने.
- 25 में 10 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के बाद और 5 मिनट के लिए 85 ° C पर प्रतिक्रिया समाप्त.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया आम तौर पर 100-250 एनजी / सीडीएनए उत्पाद के μl पैदावार. -20 में सीडीएनए उत्पादों की दुकानडिग्री सेल्सियस या वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के लिए तुरंत आगे बढ़ना.
- qPCR सही उच्च दक्षता और 14 reproducibility के साथ लक्ष्य अनुक्रम प्रतियां मात्रा ठहराना कर सकते हैं. हम qPCR SYBR ग्रीन डाई, जो केवल जब यह डबल असहाय डीएनए (dsDNA) के साथ intercalates एक फ्लोरोसेंट संकेत देता है के द्वारा मापा चुनें. TaqMan परख के रूप में 14 के रूप में विशिष्ट नहीं है हालांकि, इस विधि और अधिक लागत प्रभावी, आसान करने के लिए प्रयोगशाला में अपनाया जाना है, और qPCR के लिए और अधिक बहुमुखी प्रतिभा देता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के प्रवर्धन (2A चित्रा) साजिश और qPCR उत्पाद के व्युत्पन्न पिघलने वक्र (चित्र 2B) की जांच करने के लिए प्रतिक्रिया दक्षता और विशिष्टता को सुनिश्चित करने के.
| Histone उपप्रकारों | माउस histone नामकरण | मानव histone नामकरण | ||
| जीईपूर्वोत्तर के नाम | परिग्रहण नहीं. | जीन नाम | परिग्रहण नहीं. | |
| Histone H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histone H1b | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histone H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histone H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histone H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histone एच 1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histone H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histone H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histone H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histone H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histone Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
तालिका 1 में माउस और मानव histone एच 1 subtype है नामकरण.
- आगे डिजाइन और रिवर्स पीसीआर प्रत्येक एच 1 जीन (1 टेबल) के लिए विशिष्ट प्राइमरों. दैहिक H1S के बीच उच्च अनुक्रम केंद्रीय गोलाकार डोमेन इसी क्षेत्र में विशेष रूप से समानता के कारण, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक विशिष्ट एच 1 उप के लिए डिजाइन प्राइमरों ओ के साथ संरेखित नहींवहाँ एच 1 जीन, या पार अन्य एच 1 उपप्रकारों बढ़ाना. यह भी ध्यान दें महत्वपूर्ण है कि सबसे अधिक एच 1 जीन इंट्रोन्स शामिल नहीं है. इस प्रकार intron - फैले RT-पीसीआर के लिए आम तौर पर अपनाया जीनोमिक संक्रमण से बचने के प्राइमरों उपलब्ध नहीं हैं. इसके बजाय, शाही सेना के नमूने जाना चाहिए DNase (1.5 देखें) के साथ पूर्व इलाज के जीनोमिक संदूषण के किसी भी निशान राशि को समाप्त. इसके अलावा, आर टी (-) - qPCR समानांतर में निष्पादित किया जाना चाहिए लिए सीडीएनए नमूनों में जीनोमिक संदूषण की कमी को मान्य.
- इसके अलावा आंतरिक संदर्भ जीन, जिनकी अभिव्यक्ति नमूने के बीच में बदल रहे हैं नहीं है के लिए डिजाइन प्राइमरों. अक्सर glyceraldehyde-3-फॉस्फेट (GAPDH) डिहाइड्रोजनेज और बीटा actin के जीन के रूप में गृह व्यवस्था जीन, जीन संदर्भ के रूप में चुना जाता है. गृह व्यवस्था जीन की qPCR संकेत सामान्य नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
- 2x बुद्धि SYBR ग्रीन (जैव रेड) Supermix (युक्त dNTPs, 50 यू / एमएल iTaq डीएनए पोलीमरेज़, 6 मिमी 2 MgCl, SYBR ग्रीन मैं और 20 की 12.5 μl: निम्नलिखित के रूप में प्रत्येक पीसीआर (कुल मात्रा 25 μl) प्रतिक्रिया तैयारएनएम) fluorescein, 2/4 एनजी μl सीडीएनए, 10 आगे / रिवर्स प्राइमर मिश्रण का एनएम 1.25 μl μl, μl DDH 2 हे 9.25 और 96 पीसीआर थाली Microseal में अच्छी तरह से मिश्रण. Microseal 'बी' चिपकने वाला मुहरों (जैव रेड) का प्रयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्लेट कवर प्लेट के लिए बंद है. नल या संक्षेप में पीसीआर थाली भंवर, और नीचे एक छोटी centrifugation द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण स्पिन. MyIQ एकल रंग qPCR के लिए वास्तविक समय पीसीआर जांच प्रणाली (जैव रेड) में थाली प्लेस.
- 3 मिनट के लिए 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के बाद, 60 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड के लिए, 72 डिग्री सेल्सियस: हम निम्नलिखित qPCR की स्थिति का उपयोग करें. पीसीआर दक्षता और सीटी (चक्र के थ्रेसहोल्ड) मूल्यों के लिए प्रवर्धन घटता (2A चित्रा) की जांच करना. सीमा लाइन स्वतः IQ5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर संस्करण 2.0 द्वारा सेट किया जा सकता है.
- प्राइमर दक्षता और इष्टतम सीडीएनए एकाग्रता की जरूरत है एक मानक वक्र परख द्वारा परीक्षण किया जा सकता है, जिस में मैं जीनोमिक डीएनए के एक धारावाहिक मन्दनqPCR और सीटी मूल्यों के लिए प्रयोग किया जाता है टेम्पलेट डीएनए राशि का लॉग के खिलाफ प्लॉट किए जाते हैं. उच्च विशिष्टता और दक्षता के प्राइमरों के साथ एक अनुकूलित qPCR परख दृढ़ संकल्प के गुणांक (2 आर) 0.98> के साथ एक रैखिक मानक वक्र, दे देंगे. 200 बीपी, जो गरीब प्रवर्धन दक्षता करते हैं की तुलना में amplicon अब लंबाई के साथ प्राइमरों से बचें.
- क्योंकि SYBR ग्रीन किसी भी dsDNA का पता लगाता है, यह एक पिघलने वक्र करने के लिए सुनिश्चित करें कि वांछित amplicon है, लेकिन dimers या नहीं प्राइमर contaminants को परिलक्षित कर रहे हैं और पता चला qPCR के बाद चलाने के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है. पिघल वक्र विश्लेषण कार्यक्रम, के लिए qPCR साधन से 55 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस 0.5 में 95 डिग्री वेतन वृद्धि सी डेटा संग्रह के साथ गर्मी के नमूने. MyIQ (जैव रेड) के लिए पिघल वक्र विश्लेषण के डिफ़ॉल्ट सेटिंग उपकरण में निम्नलिखित है: 95 ° सी 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 55 ° सी, setpoint में 55 10 सेकंड 81 चक्रों के बाद के लिए डिग्री सेल्सियस, वक्र पिघल, + अस्थायी 0.5 ° C (कैमरा प्रत्येक चक्र में डेटा इकट्ठा).
- के बाद से तापमान के पिघलने dsDNA (टीएम) amplicon लंबाई और जीसी सामग्री पर निर्भर है, विभिन्न amplicons अलग टीएम (ओं) होगा. QPCR उत्पादों के व्युत्पन्न पिघलने से घटता की जांच करने के लिए वांछित amplicons विशिष्ट पिघलने तापमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शोर amplicon चोटियों (चित्रा 2 बी) की कमी की पुष्टि करने के लिए.
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए नकल या तीन प्रतियों प्रत्येक परख के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए तैयार हैं. QRT - पीसीआर के लिए आर टी के रूप में नकारात्मक नियंत्रण, शामिल हैं () (टेम्पलेट के रूप में शाही सेना के साथ रिवर्स प्रतिलेखन बिना qPCR) qPCR और नहीं सीडीएनए शाही सेना, या डीएनए पीसीआर मिश्रण में जोड़ा स्रोत के साथ qPCR. आर टी () (चित्रा 2 और 3) (आरटी) qPCR संभावित जीनोमिक डीएनए संदूषण के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं.
- QPCR IQ5 ऑप्टिकल प्रणाली सॉफ्टवेयर संस्करण 2.0 (जैव रेड) के साथ डेटा का विश्लेषण. गृह व्यवस्था (जैसे GAPDH, एसएस actin, HPRT) के जीन की अभिव्यक्ति के लिए एच 1 जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के साथ एच 1 isoform जीन की अभिव्यक्ति मान सामान्यकरें.
* सभी प्रक्रियाओं पर बर्फ या डिग्री सेल्सियस 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए
- माउस ऊतक काटना और यह बर्फ ठंड पीबीएस के साथ कुल्ला. (यदि आगे बढ़ना तुरंत निकासी के लिए नहीं, स्थिर तस्वीर और नमूने की दुकान के रूप में 1.2 चरण में वर्णित है.) धार के साथ टुकड़ों में ऊतक क़ीमा. स्थानांतरण Dounce homogenizer (बी मूसल) क़ीमा. 10 मिलीलीटर Sucrose Buffer (0.3 एम Sucrose, 15 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES के 7.9 पीएच], 2 मिमी EDTA, 0.5 मिमी PMSF, पूरी मिनी protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोली, ताजा जोड़) ऊतक के प्रति ग्राम में जोड़ें. 10-15 स्ट्रोक के साथ के ऊतक Homogenize.
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, 500 rpm पर 30 सेकंड (अपकेंद्रित्र मॉडल: Eppendorf 5810R) के लिए स्पिन homogenates स्थानांतरण, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक नया ट्यूब (गोली ऊतक मलबे में त्यागें) हस्तांतरण, और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 2000 rpm पर, गोली कोशिकाओं के लिए. 3.4 कदम आगे बढ़ें.
- यदि histones और chromatin monolayer में विकसित कोशिकाओं से निकाले जा रहे हैं, कुल्लापीबीएस के साथ, संस्कृति पकवान पीबीएस जोड़ने, और centrifugation से सेल खुरचनी, और गोली कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं फसल. निलंबन में विकसित कोशिकाओं के लिए, centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
- 10 मिलीलीटर Sucrose 0.5% NP - 40 (ग्राम ऊतक राशि या 10 (8) कोशिकाओं शुरू करने के प्रति) के साथ पूरक बफर में सेल गोली Resuspend. एक Dounce homogenizer (बी मूसल) नमूना हस्तांतरण और 20 मिनट ऊष्मायन भीतर 10 स्ट्रोक dounce के. इस बिंदु पर, नाभिक प्राप्त कर रहे हैं. एक खुर्दबीन के नीचे नाभिक गुणवत्ता की जांच. गोली 5 मिनट के लिए 2000 rpm पर centrifugation द्वारा नाभिक. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- ऊतक का 1 ग्राम या 10 (8) कोशिकाओं प्रति 3 मिलीलीटर उच्च नमक बफर (प्रत्येक का उपयोग करने से पहले ताजा जोड़ने 0.35 एम KCl, 10 मिमी Tris [पीएच 7.2], 5 मिमी 2 MgCl 0.5 मिमी PMSF के,) में नाभिक गोली Resuspend. एक छोटे Dounce homogenizer (बी मूसल) नमूना हस्तांतरण और 5-10 स्ट्रोक के साथ homogenize.
- Eppendorf 3 (1 मिलीलीटर प्रत्येक) ट्यूबों, 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, के बाद में निलंबन अशेष भाजकगोली chromatin से 10 मिनट के लिए 14,000 rpm पर centrifugation. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- प्रत्येक chromatin गोली के लिए 0.8 मिलीलीटर 0.2 2 राष्ट्रीय राजमार्ग अतः 4 जोड़ें. एक Eppendorf ट्यूब पैर dounce के प्रयोग के लिए गोली पीस अच्छी तरह से जब तक गोली पूरी तरह से अलग है. 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में एक rotating मंच पर नमूने सेते हैं. कुल histones एसिड उपचार के इस कदम के साथ निकाले जाते हैं.
- 10 मिनट के लिए 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. दो Eppendorf ट्यूबों (400 μl / ट्यूब) में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (histone अर्क). गोली त्यागें. प्रत्येक ट्यूब 2.5 बर्फ ठंड इथेनॉल की मात्रा में (1 मिलीग्राम) जोड़ें .. नमूने -20 डिग्री सेल्सियस रात भर रखें.
- गोली कुल histones को 10 मिनट के लिए 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 70% EtOH साथ गोली तीन बार धो, 20-30 सूखी हवा मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे प्रोटीन स्टोर या उन्हें DDH 2 हे में भंग और HPLC विश्लेषण करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना. सूखे प्रोटीन संग्रहीत किया जा सकता है-80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष के लिए.
4. Linker Histones की HPLC विश्लेषण
- DDH 2 हे की सिफारिश की मात्रा रिवर्स चरण स्तंभ और HPLC साधन की क्षमता पर निर्भर करता है में histone गोली Resuspend. हम HPLC विश्लेषण के लिए C18 रिवर्स चरण 250 स्तंभ x 4.6 मिमी (Vydac) और साधन Äktapurifier UPC 900 (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग करें. हम आम तौर पर विश्लेषण के लिए 100 2 0 DDH की μl में कुल histones की 50 100μg भंग.
- 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्र से अघुलनशील अवशेषों को दूर करने के लिए. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के लिए स्तंभ पर अंतःक्षिप्त किया जाना प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. HPLC प्रणाली पर रिवर्स चरण स्तंभ में कुल प्रोटीन के 50-100 μg इंजेक्षन. लोड हो रहा है प्रोटीन की एक अतिरिक्त राशि के लिए स्तंभ के clogging रोकने के लिए बचा जाना चाहिए.
- Fractionate linker के एक बढ़ती हुई acetonitrile ढाल के साथ और histones कोर histones के रूप में 2 तालिका में सूचीबद्ध है.
तालिका 2 समय के साथ ढाल बढ़ाने acetonitrile.
- प्रवाह 214 एनएम पर नजर रखी है, और HPLC प्रोफाइल (figu4 * पुनः) दर्ज की गई और गेंडा 5.11 सॉफ्टवेयर (जीई हेल्थकेयर) के साथ Äktapurifier 900 UPC (जीई हेल्थकेयर) का विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं. आगे के विश्लेषण के लिए, एसडीएस पृष्ठ जैसे और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन भिन्न ऑटो कलेक्टर (जीई frac-920) अंश के साथ भी एकत्र किया जा सकता है.
- प्रत्येक एच 1 subtype और H2B की चोटियों में से एक 214 मूल्यों प्रत्येक इसी histone प्रोटीन की पेप्टाइड बांड की संख्या से सामान्य कर रहे हैं. व्यक्ति एच 1 एच 1 परिवार के भीतर histone उपप्रकार, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एच 1 subtypes के nucleosome के मूल कणों को अनुपात के सापेक्ष अनुपात इन एक 214 मूल्यों सामान्यीकृत (चित्रा 5) से गणना की जा सकती है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
स्तनधारी एच 1 उपप्रकारों, समग्र प्रवाह संचित्र और व्यक्ति histone एच 1 जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों की सूची तालिका 1, चित्रा 1 और 2-5 चित्रा में दिखाए जाते हैं, क्रमशः.चित्रा 2A H1A qPCR का उपयोग प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट प्रवर्धन घटता दिखाता है सीडीएनए माउस जिगर और mESCs से तैयार है, जबकि चित्रा 2B इसी amplicons व्युत्पन्न पिघलने से घटता से पता चलता है. पिघलने वक्र पिघलने के तापमान (टीएम) में 86 में एक विशेषता शिखर ° सी H1A पीसीआर amplicon के लिए प्रदर्शित करता है, और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि चोटियों का अभाव है, H1A qPCR परख की उच्च विशिष्टता का सुझाव दे. प्रवर्धन साजिश (2A चित्रा) के मूल्यांकन से पता चलता है कि प्रत्येक नमूने की तीन प्रतियों qPCR प्रतिक्रियाओं लगभग समान सीटी मूल्यों के साथ अनुरूप संकेत दिया है, उच्च reproducibility सुझाव. qPCR प्रतिक्रियाओं आरटी से निर्माण amplicons की कमी () इंगित करता है कि जीनोमिक डीएनए संदूषण मौजूद है, या कम से कम नहीं था. एच 1 जीन और GAPDH जैसे गृह व्यवस्था जीन की सीटी मूल्यों का उपयोग, प्रत्येक एच 1 जीन की रिश्तेदार आरएनए अभिव्यक्ति के स्तर की गणना की गई. एच 1 ° और H1A जीन के लिए गणना परिणाम के उदाहरण में दिखाए जाते हैं H1A या mESC बनाम वयस्क माउस जिगर में एच 1 ° अभिव्यक्ति में अंतर भी है HPLC histone प्रोटीन की प्रोफाइल (चित्रा 4) से स्पष्ट है. भेदभाव विशिष्ट एच 1, एच 1 °, परिपक्व ऊतकों में एक बड़ी राशि जमा है, वयस्क जिगर में कुल एच 1 (चित्रा 5A) के 27.2% के लिए लेखांकन. इसके विपरीत में, एच 1 ° प्रोटीन undifferentiated mESCs (4B चित्रा) में लगभग अनुपस्थित है. दूसरी ओर, H1A अत्यधिक दोनों mRNA टेप और प्रोटीन में व्यक्त किया है, mESCs (चित्र 3 और 4B) में. HPLC प्रोफ़ाइल में एच 1 चोटियों की मात्रा का ठहराव के माध्यम से, प्रत्येक व्यक्ति एच 1 एच 1 परिवार के भीतर उप प्रकार के सापेक्ष अनुपात निर्धारित किया जाता है (चित्रा 5A). इसके अलावा, व्यक्तिगत एच 1 उप प्रकार के मूल्यों (याकुल) एच 1 nucleosome के प्रति सामान्यीकृत इसी एच 1 उपप्रकारों (या एच 1 के कुल योग) 214 पीक मूल्य के अनुपात से H2B के लिए 214 मूल्यों (चित्रा 5 ब) सामान्यीकृत के एक आधे के लिए गणना की जा सकती है. 
चित्रा 1 स्तनधारी linker histone उपप्रकारों की अभिव्यक्ति विश्लेषण की समग्र योजना. 
चित्रा 2 H1A qPCR परख के प्रतिनिधि परिणाम. (ए) - H1A qPCR परख का प्रवर्धन साजिश. सीमा रेखा और सीटी IQ5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित मूल्यों का संकेत कर रहे हैं. (बी) व्युत्पन्न उत्पादों की qPCR पिघल घटता (ए) में दिखाया गया है. 
चित्रा 3. MESCs और वयस्क मीटर में - H1A और एच 1 ° mRNA स्तर के विश्लेषण qRT-पीसीआरजिगर ouse. वाई अक्ष कि संदर्भ जीन GAPDH के लिए एच 1 जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है. आर टी (-) के साथ qPCR (रिवर्स प्रतिलेखन के बिना शाही सेना) नमूने कम या कोई संकेत दिखाता है. 
आंकड़ा 4. स्तनधारी कोशिकाओं से निकाले histones की HPLC विश्लेषण. उल्टा - चरण HPLC विश्लेषण 100 μg कुल के वयस्क माउस जिगर (ए) और माउस ESCs (बी) से निकाले histones. एक्स अक्ष: प्रोद्धावन समय. वाई अक्ष: MAU, milli-अवशेषी इकाइयों. 
चित्रा 5 एच 1 उप प्रकार और वयस्क माउस जिगर में nucleosome के अनुपात प्रति रचना एच 1. प्रत्येक एच 1 isoform और H2B के लिए एक चोटी के क्षेत्र के 214 मूल्यों में गेंडा 5.11 सॉफ्टवेयर (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं, और इसी histone प्रोटीन में मौजूद पेप्टाइड बांड की संख्या से सामान्य. में सामान्यीकृत एक योगसभी subtypes के एच 1 214 मूल्यों कुल एच 1 के लिए मूल्य के रूप में प्राप्त होता है. प्रत्येक एच 1 उप के लिए कुल एच 1 (ए) के प्रतिशत के रूप में अच्छी तरह nucleosome के लिए H1 के अनुपात (सामान्यीकृत H2B की 214 मूल्यों का एक आधा द्वारा प्रतिनिधित्व) (बी) वयस्क माउस जिगर में HPLC दिखाया प्रोफ़ाइल से गणना कर रहे हैं चित्रा -4 ए में.
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Discussion
assays के सेट प्रस्तुत स्तनधारी linker histone उपप्रकारों की अभिव्यक्ति के स्तर के व्यापक विश्लेषण सक्षम है. अच्छी तरह से डिजाइन qRT-पीसीआर assays के किसी भी स्तनधारी histone एच 1 जीन से अत्यधिक संवेदनशील है और सही आरएनए संदेश के माप उपलब्ध कराते हैं. linker histone उप प्रकार के जीन के लिए qRT पीसीआर assays के महत्वपूर्ण हिस्सा सीडीएनए यादृच्छिक रिवर्स प्रतिलेखन आधारित प्राइमर का उपयोग करने की तैयारी है. अधिकांश एच 1 जीन सहित सबसे histone जीन, mRNA एक लंबे पाली अन्य सेलुलर mRNAs में प्रस्तुत पूंछ शामिल नहीं है. इस प्रकार oligo-dt प्राइमरों के साथ परंपरागत रिवर्स प्रतिलेखन विधि का कुशलता से एच 1 cDNAs का उत्पादन नहीं होगा. MRNA के पाली 0 एच 1 के रूप में एक पूंछ, टेप के साथ कुछ एच 1 जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण, यादृच्छिक qRT - पीसीआर आधारित hexamers (चित्रा 3), शायद एच 1 RNAs के उच्च बहुतायत के कारण के साथ समान रूप से प्रभावी है. फिर भी, oligo-dt प्राइमरों और आरटी reac के लिए यादृच्छिक hexamers का एक मिश्रणtion के polyadenylated mRNAs है कि कम कॉपी संख्या के हैं, qRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण जीन की व्यापक कवरेज की अनुमति के आरटी दक्षता में सुधार करने के लिए अपनाया जा सकता है. qRT-पीसीआर गृह व्यवस्था जीन GAPDH, जैसे आंतरिक संदर्भ जीन, तो शामिल है कि विभिन्न ऊतकों या सेल प्रकार भर में विशिष्ट एच 1 जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में किया जा सकता है (चित्रा 3). QRT-पीसीआर मानक वक्र विश्लेषण के साथ संयोजन के द्वारा, यह भी विभिन्न नमूने (नहीं दिखाया डेटा) से एच 1 cDNAs की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या प्राप्त करने के लिए संभव है.
यहाँ हम भी histone और HPLC विश्लेषण histone प्रोटीन की निकासी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि का लाभ यह है कि एक कुल एच 1 प्रोटीन के पूल के भीतर प्रत्येक एच 1 उप प्रकार के सापेक्ष अनुपात निर्धारित के रूप में अच्छी तरह के रूप में nucleosome प्रति व्यक्ति एच 1 subtype है (और कुल एच 1) के अनुपात मात्रा ठहराना कर सकते हैं. इसके अलावा, पश्चिमी के रूप में अन्य प्रोटीन विश्लेषण के तरीकों, सोख्ता, HPLC विश्लेषण प्रो के साथ तुलना मेंसभी subtypes के एच 1 और अधिक मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप vides. सेल में एच 1 subtypes के विभिन्न स्तर और संरचना उच्च आदेश chromatin संरचना मिलाना. nucleosome के लिए एच 1 के अनुपात के chromatin संघनन साथ सहसंबंधी दिखाया गया है और 2 chromatin में nucleosome दोहराने की लंबाई के लिए एक कारक है. इस प्रकार, हम यहाँ वर्णित तरीकों chromatin के अनुसंधान में व्यापक आवेदन किया है चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH अनुदान GM085261 और एक जॉर्जिया कैंसर गठबंधन गणमान्य विद्वान पुरस्कार (YF) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
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