Summary
אנו מתארים סדרה של מבחני לנתח את רמות הביטוי של ההיסטונים מקשר H1. ה-mRNA של גנים בודדים H1 נמדדים באופן כמותי על ידי שעתוק אקראי מבוסס הפוך פריימר ואחריו בזמן אמת PCR, ואילו חלבון כימות של ההיסטונים H1 מושגת על ידי ניתוח HPLC.
Abstract
היסטון H1 מקשר נקשר החלקיקים ליבת הנוקלאוזום ו-DNA מקשר, בהנחיית מתקפל של הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 הוא חיוני להתפתחות היונקים 1 ומווסת ביטוי גנים ספציפיים in vivo 2-4. בין חלבונים היסטון השמורים באבולוציה, משפחת ההיסטונים H1 מקשר הוא קבוצה הטרוגנית ביותר. ישנם 11 תת H1 ביונקים אשר מוסדר באופן דיפרנציאלי במהלך הפיתוח בסוגי תאים שונים. אלה כוללים תת H1 5 סומטי H1s (H1a אלקטרוני), H1 החלפת 0, 4 תאים נבט תת ספציפיים H1, ואת H1x 5. נוכחות של מספר רב של תת H1 שונים בזיקה DNA מחייב יכולת הדחיסה הכרומטין 6-9 מספק רמה נוספת של אפנון של תפקוד הכרומטין. לכן, ניתוח ביטוי כמותי של תת H1 בודדים, הן של ה-mRNA וחלבונים, יש צורך להבין טוב יותר את הרגולציה של גבוההכרומטין מנת מבנה ותפקוד.
כאן אנו מתארים סדרה של מבחני המיועדים לניתוח רמות הביטוי של תת H1 בודדים (איור 1). ביטוי mRNA של גנים שונים H1 חלופה נמדדת על ידי מערכת של רגישות גבוהה וכמותית שעתוק-PCR (qRT-PCR) מבחני הפוכה, אשר מהיר יותר, מדויק יותר ודורשים דגימות הרבה פחות לעומת הגישה החלופית של ניתוח כתם הצפון. שלא כמו רוב הודעות ה-mRNA אחרים הסלולר, mRNAs עבור גנים היסטון ביותר, כולל רוב הגנים H1, חסר זנב ארוך פולה, אבל מכילים מבנה גזע לולאה על האזור מתורגמת '3 (UTR) 10. לכן, cDNAs מוכנים מ-RNA הכל על ידי שעתוק לאחור באמצעות פריימרים אקראיים במקום oligo-DT primers. זמן אמת מבחני ה-PCR עם פריימרים ספציפיים כל תת H1 (טבלה 1) מבוצעות כדי להשיג מדידה כמותית מאוד של רמות ה-mRNA של תת H1 הפרטs. הביטוי של גנים משק מנותחים כפקדי עבור נורמליזציה.
השפע היחסי של החלבונים של כל תת H1 ו ההיסטונים הליבה מתקבל דרך הפוכה כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי שלב (RP-HPLC) ניתוח של ההיסטונים הכל המופקים בתאי יונקים 11-13. שיטת HPLC ותנאי elution המתואר כאן נותנים הפרדות אופטימלי של תת H1 עכבר. על ידי לכימות פרופיל HPLC, אנו מחשבים את חלקם היחסי של תת H1 הפרט בתוך המשפחה H1, כמו גם לקבוע את H1 יחס הנוקלאוזום בתאים.
Protocol
1. לדוגמא הכנת והפקת RNA
- לפני מיצוי RNA, משטחים את כל העבודה במידה טפטפות יש לנגב עם אתנול 70% וטופלו עם פתרון טיהור RNase, כגון RNase זאפ. תרגול פעולה זו מפחיתה את הסיכוי לזיהום RNase והשפלה RNA. ללבוש כפפות על כל הנהלים.
- כדי לחלץ RNA מרקמות העכבר, לנתח את האיבר עניין של העכבר המתת חסד, ולשטוף רקמות פוספט קרח קר שנאגרו מלוחים (PBS: 0.13 M NaCl, 5 mM נתרן זרחתי heptahydrate dibasic, נתרן 5 mM heptahydrate dihydrogen פוספט, pH 7.4) . לפנות מיד RNA מיצוי בשלב 1.4. אם רקמה טרי לא להיות מעובד על RNA חילוץ, את דגימות רקמה צריך להיות הצמד קפוא בחנקן נוזלי באופן מיידי להיות מאוחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- אם RNA יש להפיק תרבית תאים חסיד, לשאוב התקשורת והתרבות, לשטוף עם כמות מספקת של PBS, ולהוסיף מגיב Trizol (מבחנהאלוף) על הצלחת לשלב 1.4. עבור תאים שגודלו תלוי, למסוק את ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה. מחק התקשורת, יש לשטוף את כדורי בקצרה עם PBS, ו גלולה את התאים עם צנטריפוגה. הוסף מגיב Trizol ולהמשיך לשלב 1.4.
- מגיב Trizol די הכרחי לקבלת RNA באיכות גבוהה. השתמש מגיב 1 מ"ל Trizol לחלץ RNA 50-100 רקמת מ"ג, 5 - 10 x 10 6 תאים (על תרבויות ההשעיה) או לכל צלחת 3.5 ס"מ על תרבויות חסיד). Homogenize רקמות מגיב Trizol עם Polytron PT2100 homogenizer (או שווה ערך). להמשיך לחלץ RNA מ דגימות רקמה או תאים על פי הוראות של היצרן עבור מגיב Trizol (Invitrogen).
- ריכוז RNA נמדדת באמצעות Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) ואיכות RNA מנותח על ידי ג'ל אלקטרופורזה. את התשואות בטווחים אופייני 1-10 מיקרוגרם של RNA לפי מ"ג של רקמה או 5-15 מיקרוגרם של רנ"א לכל 1 x 10 6 תאים בתרבית. כדי למנועאפשרות של זיהום RNA מהסכום שמץ של הדנ"א הגנומי, דגימות רנ"א מטופלים RNase ללא DNase (סיגמא המגבר-D1) בהתאם להוראות היצרן. חזור על קביעת RNA ריכוז ג'ל אלקטרופורזה על מנת להבטיח שאין השפלה של RNA מטיפול זה. חנות חילוץ RNA ב -80 ° C.
* הערה: RNA עשוי להיות מופק באמצעות ערכת RNAeasy (Qiagen) לפי הגדרות המדריך קיט, או על ידי ה-DNA / RNA KIT (Qiagen) אם הן DNA ו-RNA הם הרצוי.
2. כמותית שעתוק לאחור PCR (qRT-PCR)
- סה"כ RNA הוא עיבד הפוך לתוך מערכת cDNA באמצעות כתב עילי ראשון גדיל סינתזה III (Invitrogen). מאז ה-mRNA של גנים H1 ברוב חסר פולי-A-זנבות, חשוב להשתמש hexamers אקראיות במקום oligo-DT כמו פריימרים עבור סינתזה cDNA. עם זאת, אם ניתוח ביטוי של גנים עם הודעות polyadenylated ברמות נמוכות רצוי גם, תערובת של hexamers אקראיים oligo-DT שוLD לשמש את התגובה ההפוכה תעתיק (RT) כדי לשפר את היעילות שעתוק לאחור של mRNAs polyadenylated.
- בצע את התגובה RT פי הוראות היצרן. בקצרה,
- ב צינור 0.5 PCR מ"ל, לשלב 5 מיקרוגרם של רנ"א הכל, 1 μl של 50 hexamers אקראיים ng / μl, 1 μl של תערובת 10 mM dNTP, ולהוסיף DEPC שטופלו H 2 O כדי להפוך את אמצעי האחסון התגובה הכוללת, כמו μl 10. מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ואחריו הדגירה 1 דקה על הקרח.
- הכן 10 μl של מיקס סינתזה cDNA: 2 μl מאגר 10xRT, 4 μl של 25 מ"מ MgCl 2, 2 μl של 0.1M DTT, 1 μl של RNaseOut (40 U / μl), 1 μl של כתב עילי III RT (200 U / μl) ולהוסיף אותו לתערובת RNA / פריימר.
- דגירה במשך 10 דקות במהירות של 25 ° C, ולאחר מכן 50 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, לסיים את התגובה על 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- התגובה של כל מניב בדרך כלל 100-250 ng / μl של המוצר cDNA. לאחסן מוצרים cDNA ב -20° C או להמשיך מיד בזמן אמת כמותי PCR (QPCR).
- QPCR יכול במדויק לכמת את רצף היעד עותקים עם יעילות גבוהה reproducibility 14. אנחנו בוחרים למדוד QPCR ידי SYBR צבע ירוק, אשר נותן אות ניאון רק כאשר intercalates עם גדילי הדנ"א הכפול (dsDNA). אם כי לא ספציפית כמו Taqman assay 14, שיטה זו הוא יותר חסכוני, קל יותר לאמץ במעבדה, והוא נותן צדדיות יותר QPCR. לכן, חשוב לבחון את העלילה ההגברה (איור 2 א) ו עקומות ההיתוך נגזרות של המוצר QPCR (איור 2 ב) על מנת להבטיח יעילות התגובה וספציפיות.
| היסטון תת | עכבר היסטון המינוח | המינוח היסטון האדם | ||
| גהנה שם | ההצטרפות לא. | שם הגן | ההצטרפות לא. | |
| היסטון H1a | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| היסטון H1b | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| היסטון H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| היסטון H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| היסטון H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| היסטון H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| היסטון H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| היסטון H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| היסטון H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| היסטון H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| היסטון Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
טבלה 1. היסטון H1 תת המינוח של העכבר האנושי.
- עיצוב קדימה ולהפוך primers ה-PCR ספציפיים עבור כל גן H1 (טבלה 1). בשל הדמיון בין רצף גבוה סומטי H1s, במיוחד באזור המתאים לתחום כדורי מרכזי, חיוני כדי להבטיח את פריימרים המיועדים תת H1 ספציפית לא להתיישר עם oיס גנים H1, או לחצות להגביר תת H1 אחרים. כמו כן, חשוב לציין כי ברוב הגנים H1 אינם מכילים אינטרונים. כך אינטרון למוצרי פורש primers מאומצים בדרך כלל עבור RT-PCR, כדי למנוע זיהום גנטי אינן זמינות. במקום זאת, דגימות רנ"א יש מראש שטופלו DNase (ראה 1.5) לחסל את כל כמות עקבות של זיהום גנטי. בנוסף, RT (-)-QPCR יש לבצע במקביל כדי לאמת חוסר זיהום גנטי של דגימות cDNA.
- גם לעצב primers עבור גנים התייחסות פנימיים, אשר הביטוי אינן משתנות בין דגימות. לעתים קרובות גנים משק הבית, כגון dehydrogenase glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH) ו-ביתא אקטין גנים נבחרים, כמו גנים הפניה. אותות QPCR של גנים משק לשמש שולטת נורמליזציה.
- הכן את כל התגובה PCR (הנפח הכולל 25 μl) כדלקמן: 12.5 μl של 2x IQ SYBR גרין Supermix (Bio-Rad) (dNTPs, המכילים 50 U / ml iTaq פולימראז ה-DNA, 6 מ"מ MgCl 2, SYBR הירוק אני 20nM fluorescein), 2 μl של 4 μl 1.25 ng / μl cDNA, של 10 ננומטר קדימה / לערבב צבע יסוד הפוכה, ו 9.25 μl של DDH 2 O, ומערבבים היטב Microseal 96-PCR גם צלחת. השתמש אטמים דבק 'ב' Microseal (BIO-RAD) כדי להבטיח את כיסוי צלחת חתום על הצלחת. לחץ או בקצרה מערבולת את הצלחת ה-PCR, ומסובב את התערובות תגובה על ידי צנטריפוגה קצר. מניחים את הצלחת MyIQ מערכת אחת בזמן אמת צבע איתור PCR (BIO-RAD) עבור QPCR.
- אנו משתמשים QPCR התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לבחון את הקימורים הגברה (איור 2 א) על PCR יעילות ו-CT (סף של מחזור) ערכים. קו הסף ניתן להגדיר באופן אוטומטי על ידי תוכנה IQ5 אופטיים מערכת 2.0 גירסה.
- יעילות פריימר וריכוז cDNA אופטימלית צורך, ניתן לבדוק על ידי assay עקומת רגיל, שבו דילול הסידורי של הדנ"א הגנומי אנישל משמש QPCR וערכים ה-CT הם זממו נגד יומן של כמות ה-DNA תבנית. Assay QPCR אופטימיזציה עם פריימרים של סגוליות יעילות גבוהה ייתן עקומת סטנדרט לינארית, עם מקדם של נחישות (R 2)> 0.98. הימנע primers עם אורך amplicon עוד מ -200 נ"ב, אשר נוטים להיות יעילות הגברה עניים.
- בגלל SYBR הירוק מזהה כל dsDNA, חשוב לבצע עקומת התכה ריצה בעקבות QPCR על מנת להבטיח כי amplicon הרצוי, אך לא הדימרים פריימר או מזהמים, הם מוגבר זוהה. תוכנית להמיס-עקומת ניתוח, מכשיר QPCR לחמם את דגימות מ 55 ° C עד 95 ° C ב 0.5 מעלות צלזיוס במרווחים באיסוף הנתונים. הגדרת ברירת המחדל של ניתוח להמיס-עקומת עבור MyIQ (BIO-RAD) המכשיר הוא: 95 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה, 55 ° C למשך דקה 1, ואחריו 81 מחזורים של 10 שניות ב setpoint 55 מעלות צלזיוס, נמסים עקום, + טמפ 0.5 מעלות צלזיוס (המצלמה אוספת נתונים על כל מחזור).
- מאז טמפרטורת התכה (TM) של dsDNA תלוי באורך amplicon ותוכן GC, amplicons שונים יהיו אני שונה (ים). לבחון את הקימורים ההיתוך נגזרות של המוצרים QPCR לאשר את טמפרטורת ההתכה מסוים של amplicons הרצויים, כמו גם את חוסר amplicon פסגות רעש (איור 2 ב).
- הכן לשכפל או בשלושה עותקים תגובות עבור assay כל לניתוח סטטיסטי. כלול בקרות שליליות על qRT-PCR, כגון RT (-)-QPCR (QPCR עם RNA כתבנית ללא שעתוק לאחור) ו QPCR ללא cDNA, RNA או DNA מקור נוסף בתמהיל PCR. RT (-)-QPCR יכול לשמש בקרה על אפשרות של זיהום ה-DNA הגנומי (RT) - (באיור 2 & 3).
- ניתוח נתונים QPCR עם IQ5 אופטי תוכנת מערכת גירסה 2.0 (BIO-RAD). לנרמל את ערכי הביטוי של גנים H1 איזופורם עם הבעה של משק בית גן (למשל GAPDH, SS-אקטין, HPRT) להשיג רמות הביטוי היחסיות של הגנים H1.
* הליכי כל יש לבצע על הקרח או על 4 ° C.
- לנתח רקמות העכבר ולשטוף אותו עם קרח קר PBS. (אם לא המשך מיצוי מיידי, הצמד להקפיא ולאחסן את דגימות כפי שמתואר בשלב 1.2.) בשר טחון הרקמה לחתיכות עם סכין גילוח. העברת לרכך את homogenizer Dounce (ב 'העלי). הוסף 10 מ"ל סוכרוז חוצץ (סוכרוז 0.3 M, 15 mM NaCl, 10 HEPES מ"מ [pH 7.9], 2 mM EDTA, 0.5 מ"מ PMSF, מיני השלם מעכבי פרוטאז Tablet קוקטייל, להוסיף טרי) לכל גרם של רקמה. Homogenize רקמות 10-15 עם שבץ.
- להעביר את homogenates לצינור 15 מ"ל, ספין בסל"ד 500 למשך 30 שניות (דגם צנטריפוגה: Eppendorf 5810R); בזהירות להעביר supernatant לצינור חדש (להשליך את הפסולת גלולה-רקמות), וכן צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 5 דקות, לתאים גלולה. עבור לשלב 3.4.
- אם ההיסטונים וכרומטין יש להפיק תאים שגודלו monolayer, לשטוףעם PBS, להוסיף PBS לצלחת תרבות, למסוק את התאים באמצעות מגרד תא, ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה. עבור תאים שגודלו ההשעיה, תאים גלולה על ידי צנטריפוגה.
- Resuspend תא גלולה במאגר 10 מ"ל סוכרוז השלימו עם 0.5% NP-40 (לגרם החל כמות הרקמה או 10 (8) תאים). להעביר את המדגם כדי homogenizer Dounce (ב 'העלי) ו dounce 10 תנועות בתוך 20 דקות הדגירה. בשלב זה, גרעינים מתקבלים. לבחון את איכות גרעינים תחת מיקרוסקופ. גלולה גרעינים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 5 דקות. מחק supernatant.
- Resuspend גרעינים גלולה במאגר מ"ל 3 מליחות גבוהה (0.35 מ 'KCl, 10 mM טריס [pH 7.2], 5 מ"מ MgCl 2, 0.5 מ"מ PMSF - להוסיף טרי לפני כל שימוש) לכל גרם 1 של רקמה או 10 (8) תאים. להעביר מדגם קטן Dounce homogenizer (ב 'העלי) ו homogenize עם משיכות 5-10.
- Aliquot השעיה ל 3 צינורות Eppendorf (1 מ"ל כל אחד), דגירה על קרח במשך 20 דקות, ואחריוצנטריפוגה בסל"ד 14,000 במשך 10 דקות עד גלולה הכרומטין. מחק supernatant.
- הוסף 0.8 מ"ל 0.2 NH 2 SO 4 לכל גלולה הכרומטין. השתמש dounce העלי eppendorf צינור לטחון את הכדור טוב עד גלולה הוא ניתק לחלוטין. דגירה דגימות על במה מסתובבת ב 4 ° C למשך הלילה. ההיסטונים סך חילוץ עם שלב זה של הטיפול בחומצה.
- סרכזת בסל"ד 14,000 במשך 10 דקות. להעביר את supernatant (תמציות היסטון) לשני צינורות Eppendorf (400 μl / צינורית). מחק גלולה. הוסף 2.5 כרכים (1 מ"ל) של אתנול קרח קר צינור זה .. לשמור את דגימות ב -20 מעלות למשך הלילה.
- סרכזת בסל"ד 14,000 במשך 10 דקות עד ההיסטונים גלולה בסך הכל, לבטל את supernatant. לשטוף שלוש פעמים גלולה עם EtOH 70%, להשאיר על הספסל למשך 20-30 דקות באוויר יבש. אחסן את החלבונים יבשים ב -80 ° C או לפזר אותם DDH 2 O והמשך ניתוח HPLC מיד. חלבונים יבשים ניתן לאחסןב -80 ° C עד שנה 1.
4. HPLC ניתוח של ההיסטונים מקשר
- Resuspend גלולה היסטון בהיקף המומלצת של DDH 2 O בהתאם לקיבולת של עמוד הפוך שלב ואת מכשיר HPLC. אנו משתמשים בשלב C18 טור הפוך 250 X 4.6 מ"מ (Vydac) ו Äktapurifier UPC 900 המכשיר (GE Healthcare) עבור ניתוח HPLC. אנחנו בדרך כלל לפרק 50-100μg של ההיסטונים מסך 100 μl של DDH 2 0 לניתוח.
- סרכזת בסל"ד 14,000 במשך 5 דקות להסרת שאריות מסיס. Assay ברדפורד חלבון משמש כדי לקבוע את כמות החלבון להיות מוזרק לתוך הטור. להזריק 50-100 מיקרוגרם של חלבון הכוללת את העמודה בשלב הפוכה על מערכת HPLC. טוען סכום עודף של חלבון יש להימנע כדי למנוע סתימת העמודה.
- Fractionate את ההיסטונים מקשר ו ההיסטונים הליבה עם שיפוע אצטוניטריל הגדלת רשום בטבלה 2.
טבלה 2. הגדלת שיפוע אצטוניטריל לאורך זמן.
- השפכים מנוטר על 214 ננומטר, ו פרופילים HPLC (FiguRe 4) נרשמות ונותחו באמצעות Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) עם UNICORN 5.11 תוכנה (GE Healthcare). שברים את החלבון ניתן לאסוף גם חלק אוטומטי נציב (frac-920 - GE) לניתוח נוסף, ספקטרומטריית למשל SDS-PAGE ומסה.
- א '214 ערכים של פסגות תת סוג זה H1 ו-H2B הם מנורמל במספר אג"ח פפטיד של חלבון בכל היסטון המקביל. חלקם היחסי של תת H1 בודדים היסטון H1 בתוך המשפחה, כמו גם יחס של תת H1 לחלקיקים הליבה הנוקלאוזום ניתן לחשב אותם מנורמל מספר 214 ערכים (איור 5).
5. נציג תוצאות
רשימה של תת H1 יונקים, תרשים זרימה הכולל ותוצאות נציג של ניתוח ביטוי של גנים בודדים היסטון H1 מוצגים בלוח 1, איור 1, איור 2-5, בהתאמה.איור 2 א מראה עקומות הגברה של תגובות טיפוסיות H1a QPCR באמצעות cDNA שהוכן מהכבד העכבר mESCs, ואילו איור 2B מראה את עקומות ההיתוך נגזרת של amplicons המתאימים. עקומת התכה מציגה שיא מאפיין יחיד בטמפרטורת ההיתוך (TM) בשעה 86 ° C ל-PCR H1a amplicon, וחסר שאינם ספציפיים פסגות רקע, דבר המצביע על סגוליות גבוהה של assay QPCR H1a. הערכת העלילה ההגברה (איור 2 א) עולה כי QPCR בשלושה עותקים התגובות של מדגם זה נתן אותות בקנה אחד עם ערכים זהים כמעט CT, דבר המצביע על שחזור גבוהה. חוסר amplicons הצטברות של RT (-)-QPCR התגובות עולה כי זיהום הדנ"א הגנומי לא היה נוכח, או מינימלית. ניצול ערכי ה-CT של גנים H1 וגנים משק הבית, כגון GAPDH, רמות יחסית רנ"א הביטוי של כל גן H1 חושבו. דוגמאות לתוצאות שחושב H1 ° וגנים H1a מוצגים ההבדל ביטוי H1a או H1 ° בכבד העכבר המסקלין לעומת מבוגר ניכר גם פרופילים מ-HPLC של חלבונים היסטון (איור 4). H1 °, H1 בידול מסוים, מצטבר לסכום גדול ברקמות בוגרים, המהווה 27.2% מתוך סך H1 בכבד המבוגר (5 א 'איור). לעומת זאת, החלבון ° H1 נעדר כמעט mESCs שלא עברו התמיינות (איור 4B). מצד שני, H1a בא לידי ביטוי ביותר, הן תעתיקי mRNA וחלבונים, ב mESCs (איור 3 & 4 ב). באמצעות כימות של פסגות H1 בפרופיל HPLC, חלקם היחסי של כל תת H1 הפרט בתוך המשפחה H1 נקבע (5 א 'איור). יתר על כן, את הערכים של תת H1 הפרט (אוH1 הכולל) לכל הנוקלאוזום יכול להיות מחושב על ידי היחס בין ערך מנורמל 214 לשיא של תת H1 המתאים (או סכום כולל H1) לחצי אחד מנורמל מספר 214 ערכים עבור H2B (5 ב איור). 
באיור 1. תוכנית כוללת של ניתוח ביטוי מקשר-היסטון תת יונקים. 
איור 2. תוצאות נציג של assay QPCR H1a. (א) הגברה חלקת assay QPCR H1a. קו סף ערכי ה-CT שקבעה תוכנה IQ5 מערכת אופטית מצוינים. (ב) נגזרים התכה עקומות של מוצרים QPCR שמוצג (א '). 
3. איור qRT-PCR ניתוח של רמות ה-mRNA של H1a ו H1 מעלות mESCs ומבוגרים מ 'ouse הכבד. ציר Y מייצג את רמות הביטוי היחסיות של הגנים H1 לזה של הגן התייחסות GAPDH. QPCR עם RT (-) דגימות (RNA ללא שעתוק לאחור) מראה אותות מינימלית, אם בכלל. 
4. איור HPLC ניתוח של ההיסטונים המופקים בתאי יונקים. הפוך שלב HPLC ניתוח של 100 מיקרוגרם ההיסטונים הכל שחולצו מן הכבד עכבר בוגר (A) ESCs העכבר (ב '). ציר X: זמן elution. ציר Y: מאו, אלפית לספיגה יחידות. 
איור 5. בהרכב תת H1 ו-H1 לכל יחס הנוקלאוזום בכבד עכבר בוגר. א '214 ערכים של אזור השיא של כל איזופורם H1 ו-H2B מחושבים באמצעות UNICORN 5.11 תוכנה (GE Healthcare), ו מנורמל במספר אג"ח פפטידים הנמצאים חלבון היסטון המקביל. סכום מנורמל214 הערכים של כל תת H1 מתקבל כערך עבור H1 מוחלט. אחוז H1 סך כל תת H1 (), כמו גם היחס בין H1 ל הנוקלאוזום (המיוצג על ידי חצי אחד מנורמל מספר 214 ערכי H2B) (ב) בכבד עכבר מבוגר מחושבים מהפרופיל HPLC הראה ב איור 4 א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קבוצה של מבחני שהוצג לאפשר ניתוח מקיף של רמות הביטוי של יונקים תת היסטון מקשר. מתוכנן כראוי qRT-PCR מבחני לספק מדידות רגישות גבוהה ומדויקת של הודעות רנ"א של כל הגנים יונקים היסטון H1. חלק חשוב של qRT-PCR מבחני עבור מקשר גנים תת היסטון הוא הכנת cDNA באמצעות צבע יסוד על בסיס אקראי שעתוק לאחור. ה-mRNA של גנים היסטון ביותר, כולל גנים H1 ביותר, אינם מכילים עוד מרובה הזנב מוצגים mRNAs סלולריים אחרים. לכן השיטה המסורתית שעתוק לאחור עם oligo-DT primers לא יהיה יעיל לייצר cDNAs H1. ניתוח ביטוי של גנים H1 מעט עם תעתיקי mRNA המכילים פולי-A זנבות, כגון H1 0, הוא יעיל באותה מידה עם hexamers אקראיים המבוססים qRT-PCR (איור 3), ככל הנראה בשל ריבוי גבוה של RNAs H1. אף על פי כן, תערובת של oligo-DT primers ואת hexamers אקראית RT reaction ניתן לאמץ כדי לשפר את היעילות של RT mRNAs polyadenylated כי הם מספרים להעתיק נמוכים, ומאפשר כיסוי רחב יותר של גנים שנבדקו על ידי qRT-PCR. qRT-PCR של גנים התייחסות פנימיים, כגון ניהול משק בית גן GAPDH, כלולה, כך רמת הביטוי היחסית של גנים ספציפיים על פני H1 רקמות שונות או סוגי תאים ניתן להשוות (איור 3). על ידי שילוב של qRT-PCR עם ניתוח עקומת סטנדרטי, אפשר גם לקבל עותק מספרים מוחלטים של cDNAs H1 ממדגמים שונים (מידע לא מוצג).
כאן אנו גם מתארים את הפרוטוקולים של החילוץ היסטון וניתוח HPLC של חלבונים היסטון. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לקבוע את הפרופורציות היחסיות של כל תת H1 בתוך בריכה של חלבונים H1 הכוללת, כמו גם לכמת את היחס בין תת H1 הפרט (ו H1 הכולל) לכל הנוקלאוזום. בנוסף, לעומת אחרים שיטות ניתוח חלבון, כגון המערבי סופג, ניתוח Pro HPLCבנאווידס מדידות כמותיות יותר לשחזור של כל תת H1. רמות שונות והרכב תת H1 בתא גבוה יותר לווסת את מבנה הכרומטין סדר. היחס בין H1 ל הנוקלאוזום הוכח לתאם עם דחיסה הכרומטין הוא הקובע לאורך חוזרת הנוקלאוזום ב הכרומטין 2. לכן, השיטות שתוארו כאן אנחנו צריכים יישומים רחב של מחקר הכרומטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק GM085261 ואת הקואליציה סרטן גאורגיה פרס נכבדים Scholar (כדי YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
