Summary
Vi beskriver et sett av metoder for å analysere uttrykk nivåer av H1 dennes histoner. mRNA av individuelle H1 gener kvantitativt måles ved tilfeldig primer basert revers transkripsjon etterfulgt av real-time PCR, mens protein kvantifisering av H1 histoner oppnås ved HPLC analyse.
Abstract
Linker histone H1 binder seg til nucleosome kjernen partikkel og linker DNA, tilrettelegging bretting av kromatin til høyere orden struktur. H1 er avgjørende for pattedyr utvikling 1 og regulerer spesifikke genuttrykk in vivo 2-4. Blant de svært bevart histonproteiner, er familien til H1 dennes histoner den mest heterogene gruppen. Det er 11 H1 subtyper i pattedyr som er ulikt regulert under utvikling og i ulike celletyper. Disse H1 subtyper omfatter fem somatiske H1S (H1A-e), utskifting H1 0, 4 bakterie celle spesifikke H1 subtyper, og H1x 5. Tilstedeværelsen av flere H1 undertyper som varierer i DNA bindende affinitet og kromatin komprimering evne 6-9 gir et ekstra nivå av modulering av kromatin funksjon. Dermed er kvantitativ uttrykk analyse av individuelle H1 subtyper, både av mRNA og proteiner, er nødvendig for bedre forståelse av reguleringen av høyereFor kromatinstruktur og funksjon.
Her beskriver vi et sett av metoder utviklet for å analysere uttrykket nivåer av enkelte H1 undertyper (figur 1). mRNA uttrykk av ulike H1 variant gener måles ved et sett av svært sensitive og kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) analyser, som er raskere, mer nøyaktig og krever mye mindre prøver sammenlignet med alternativ tilnærming av utrykt. I motsetning til de fleste andre cellulære mRNA meldinger, mRNA for det meste histone gener, deriblant de fleste H1 gener, mangler en lang Polya hale, men inneholder en stilk-løkke struktur på 3 'uoversatt region (UTR) 10. Derfor er cDNAs forberedt fra total RNA ved revers transkripsjon bruke tilfeldige primere stedet for oligo-DT primere. Realtime PCR analyser med primere spesifikke for hver H1 subtypene (tabell 1) er utført for å oppnå svært kvantitativ måling av mRNA nivåer av enkelte H1 subtypes. Uttrykk av rengjøringstjenester gener analyseres som kontroller for normalisering.
Den relative overflod av proteiner til hvert H1 subtype og kjernen histoner oppnås gjennom omvendt fase med høy ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) analyse av totalt histoner hentet fra mammalske celler 11-13. HPLC-metoden og eluering forholdene beskrevet her gi optimale separasjoner av mus H1 subtyper. Ved å kvantifisere HPLC profilen, beregner vi den relative andelen av individuelle H1 subtyper innenfor H1 familie, samt bestemme H1 til nucleosome ratio i cellene.
Protocol
1. Prøveopparbeidelse og RNA Utvinning
- Før RNA ekstraksjon, bør alle som arbeider overflater og pipetter tørkes med 70% etanol og behandles med RNase dekontaminering løsning, som RNase Zap. Denne praksisen reduserer sjansene for RNase forurensning og RNA degradering. Bruk hansker for alle prosedyrer.
- Hvis du vil trekke RNA fra mus vev, dissekere organ interesse fra avlives mus, og vaske vevet i iskalde Fosfatbufret saltvann (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mm Sodium Dinatriumhydrogenfosfat heptahydrat, 5 mm Sodium dihydrogen phosphate heptahydrat, pH 7,4) . Fortsett straks til RNA ekstraksjon i trinn 1.4. Hvis frisk vev er ikke å bli behandlet for RNA ekstraksjon, bør vevsprøver være snap frosset i flytende nitrogen umiddelbart og lagres ved -80 ° C for senere bruk.
- Hvis RNA er å bli hentet fra tilhenger cellekultur, aspirer dyrkingsmedier, skyll med tilstrekkelig mengde PBS, og legg Trizol reagens (in vitrogen) på tallerkenen og fortsett til trinn 1.4. For celler dyrket i suspensjon, høste celler og pelletskaminer celler ved sentrifugering. Kast media, skyll pellets kort med PBS, og pellet cellene med sentrifugering. Legg Trizol reagens og fortsett til trinn 1.4.
- Tilstrekkelig Trizol Reagens er nødvendig for å oppnå høy kvalitet RNA. Bruk 1 ml Trizol Reagent å trekke RNA 50-100 mg vev, 5 - 10 x 10 6 celler (for suspensjon kulturer) eller pr 3,5 cm plate (for heftende kulturer). Homogenisere vevet i Trizol Reagens med Polytron PT2100 homogenizer (eller tilsvarende). Fortsett å trekke RNA fra vevsprøver eller celler i henhold til produsentens håndbok for Trizol reagens (Invitrogen).
- RNA konsentrasjon måles med Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) og RNA kvalitet er analysert ved gel elektroforese. De typiske kapasitet varierer fra 1-10 mikrogram RNA per mg av vev eller 5-15 mikrogram RNA per 1 x 10 6 dyrkede celler. For å eliminerepotensiell forurensning av RNA fra spor mengde genomisk DNA, blir RNA prøver behandlet med RNase-fritt DNase (Sigma AMP-D1) i henhold til produsentens instruksjoner. Gjenta RNA konsentrasjon besluttsomhet og gel elektroforese for å sikre at ingen degradering av RNA fra denne behandlingen. Oppbevares utvinnes RNA ved -80 ° C.
* Merk: RNA kan også trekkes ut ved hjelp RNAeasy kit (Qiagen) i henhold til settet manuell, eller ved DNA / RNA kit (Qiagen) dersom både DNA og RNA er ønskelig.
2. Kvantitativ Reverse Transcription PCR (QRT-PCR)
- Total RNA er omvendt transkribert til cDNA ved hjelp Hevet III Første tråd Synthesis System (Invitrogen). Siden mRNA av de fleste H1 gener mangler poly-A-haler, er det avgjørende å bruke tilfeldige heksamer stedet for oligo-dT som primere for cDNA syntese. Men hvis uttrykket analyse av gener med polyadenylated meldinger lave nivåer er også ønskelig, en blanding av tilfeldige heksamer og oligo-dT Should brukes i revers transkripsjon (RT) reaksjon å forbedre revers transkripsjon effektiviteten polyadenylated mRNA.
- Utfør RT reaksjon i henhold til produsentens manual. Kort,
- I en 0,5 ml PCR rør, kombinere 5 mikrogram av totalt RNA, en mL av 50 ng / mL tilfeldige heksamer, 1 mL av 10 mM dNTP mix, og legg DEPC behandlet H 2 O for å gjøre den samlede reaksjonen volum som 10 mL. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 65 ° C, etterfulgt av 1 minutt inkubasjon på is.
- Forbered 10 mL av cDNA syntese Mix: 2 mL av 10xRT buffer, 4 mL av 25 mm 2 MgCl, 2 mL av 0.1m DTT, 1 mL av RNaseOut (40 U / mL), 1 mL av Hevet III RT (200 U / mL) og legge den til RNA / primer blanding.
- Inkuber i 10 minutter ved 25 ° C, etterfulgt av 50 minutter ved 50 ° C og avslutte reaksjonen ved 85 ° C i 5 minutter.
- Hver reaksjon gir vanligvis 100-250 ng / mL av cDNA produktet. Oppbevar cDNA produkter ved -20° C eller fortsette umiddelbart for sanntids kvantitativ PCR (qPCR).
- qPCR kan nøyaktig tallfeste målet sekvens kopier med høy effektivitet og reproduserbarhet 14. Vi velger qPCR målt ved SYBR grønt fargestoff, som gir en fluorescerende signal bare når det intercalates med dobbel-strandet DNA (dsDNA). Selv om ikke så spesifikk som Taqman assay 14, er denne metoden mer kostnadseffektivt, lettere å bli vedtatt i laboratoriet, og gir mer allsidighet til qPCR. Derfor er det viktig å undersøke forsterkning plottet (Figur 2A) og avledede smelting kurvene i qPCR produktet (figur 2B) for å sikre reaksjon effektivitet og spesifisitet.
| Histone subtyper | Mus histone nomenklatur | Menneskelig histone nomenklatur | ||
| Gene navn | Tiltredelse nei. | Gene navn | Tiltredelse nei. | |
| Histone H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histone H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histone H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histone H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histone H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histone H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histone H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histone H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histone H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histone H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histone Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tabell 1. Histone H1 subtype nomenklatur i mus og menneske.
- Design forover og bakover PCR primere spesifikke for hver H1 gen (tabell 1). På grunn av den høye sekvensen likhetstrekk mellom somatisk H1S, særlig i regionen som tilsvarer den sentrale globular domenet, er det avgjørende å sikre at primere designet for en bestemt H1 subtype ikke justere med other H1 gener, eller kryss forsterke andre H1 subtyper. Det er også viktig å merke seg at de fleste H1 gener ikke inneholder introner. Dermed intronsekvenser-spenner primere typisk vedtatt for RT-PCR for å unngå genomisk forurensning er ikke tilgjengelige. I stedet bør RNA prøver bør behandles med DNase (se 1.5) for å eliminere alle spor mengde genomisk forurensning. I tillegg RT (-) bør-qPCR utføres parallelt for å validere manglende genomisk forurensning i cDNA prøvene.
- Også designe primere for interne referansenummer gener, hvis uttrykk endres ikke blant prøvene. Ofte housekeeping gener som glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og beta-aktin gener, er valgt som referanse gener. qPCR signaler om housekeeping gener tjene som normalisering kontroller.
- Forbered hver PCR-reaksjon (totalt volum 25 mL) som følgende: 12,5 mL av 2x IQ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad) (inneholder dNTPs, 50 U / ml iTaq DNA polymerase, 6 mm 2 MgCl, SYBR Grønn jeg og 20nM fluorescein), 2 mL av 4 ng / mL cDNA, 1,25 mL av 10 nM forover / bakover primer mix, og 9,25 mL av DDH 2 O, og bland godt i Microseal 96-brønnen PCR plate. Bruk Microseal 'B' Selvklebende Seals (Bio-Rad) for å sikre at platen dekselet er forseglet til plate. Trykk eller kort vortex PCR plate, og spinner ned reaksjonsblandingene med en kort sentrifugering. Sett platen i MyIQ Ensfarget real-time PCR Detection System (Bio-Rad) for qPCR.
- Vi bruker følgende qPCR vilkår: 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder. Undersøk forsterkningsbehov kurvene (figur 2a) for PCR effektivitet og CT (Terskel av syklusen) verdier. Terskelen linje kan automatisk settes av IQ5 Optical System Software versjon 2.0.
- Primeren effektivitet og optimal cDNA konsentrasjon nødvendig kan testes ved en standard kurve analyse, der en seriell fortynning av genomisk DNA ier brukt for qPCR og Ct-verdier plottet mot log mal DNA beløp. En optimalisert qPCR assay med primere med høy spesifisitet og effektivitet vil gi en lineær standardkurve, med koeffisienten (R 2)> 0,98. Unngå primere med fragment lengde lenger enn 200 bp, noe som pleier å ha dårlig kasjonseffektivitet.
- Fordi SYBR Grønn oppdager dsDNA, er det avgjørende å utføre en smeltende kurve løp etter qPCR å sikre at ønsket fragment, men ikke primer dimer eller forurensninger, er forsterket og oppdaget. For smelte-kurve analyse, programmere qPCR instrumentet for å varme opp prøvene fra 55 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller med datainnsamling. Standardinnstillingen smelte-kurve analyse for MyIQ (Bio-Rad) instrument er følgende: 95 ° C i 1 minutt, 55 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 81 sykluser på 10 sekunder ved settpunkt 55 ° C, smelter kurve, + Temp 0.5 ° C (kamera samler data ved hver syklus).
- Siden smeltetemperaturen (Tm) av dsDNA er avhengig fragment lengde og GC innhold, vil ulike amplikonene ha forskjellig Tm (s). Undersøk derivative smeltende kurvene i qPCR produktene for å bekrefte den spesifikke smeltetemperaturen av ønskede amplikonene samt mangelen på støy fragment topper (figur 2B).
- Forbered duplisere eller tredoble reaksjoner for hver analyse for statistisk analyse. Inkluder negative kontroller for QRT-PCR, slik som RT (-)-qPCR (qPCR med RNA som mal uten revers transkripsjon) og qPCR uten cDNA, RNA eller DNA kilde lagt i PCR mix. RT (-)-qPCR kan tjene som kontroll for potensiell genomisk DNA forurensning (RT (-) i figur 2 og 3).
- Analyser qPCR data med IQ5 Optical System Software versjon 2.0 (Bio-Rad). Normalisere uttrykket verdiene av H1 isoform gener med uttrykket av husholdningsgenet (f.eks GAPDH, ß-aktin, hprt) for å få relative uttrykk nivåer av H1 gener.
* Alle prosedyrer bør utføres på is eller ved 4 ° C.
- Dissekere mus vev og skyll den med iskald PBS. (Hvis ikke videre til utvinning umiddelbart, knipse fryse og lagre prøvene som beskrevet i trinn 1.2.) Finhakk vevet i stykker med barberblad. Overfør kjøttdeig til en Dounce homogenizer (B stampe). Tilsett 10 ml Sukrose buffer (0,3 M Sukrose, 15 mM NaCl, 10 mm HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, Komplett Mini proteasehemmer Cocktail Tablet, legg fersk) per gram vev. Homogenisere vevet med 10-15 slag.
- Overfør homogenat til en 15 ml tube, spinn på 500 rpm i 30 sekunder (sentrifuge modell: Eppendorf 5810R); nøye overføre supernatanten til et nytt rør (forkaste pellet-vev rusk), og sentrifuger ved 2000 rpm i 5 minutter, til pellet celler. Gå videre til trinn 3.4.
- Hvis histoner og kromatin skal trekkes ut fra celler dyrket i monolayer, skyllmed PBS, legger PBS til kultur fatet, og høste celler ved hjelp av celle skraper, og pelletskaminer celler ved sentrifugering. For celler dyrket i suspensjon, pellet cellene ved sentrifugering.
- Resuspender cellen pellet i 10 ml Sukrose Buffer supplert med 0,5% NP-40 (per gram starter vev beløp eller 10 (8) celler). Overfør prøven til en Dounce homogenizer (B stampe) og dounce 10 slag i løpet av 20 minutter inkubasjonstid. På dette punktet, er atomkjerner innhentet. Undersøk kjerner kvalitet under et mikroskop. Pellet kjernene ved sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter. Kast supernatanten.
- Resuspender kjerner pellet i 3 ml Høy Salt buffer (0.35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mm 2 MgCl, 0,5 mM PMSF - legg frisk før hver bruk) per 1 g vev eller 10 (8) celler. Overfør prøven til en liten Dounce homogenizer (B stampe) og homogenisere med 5-10 slag.
- Delmengde suspensjon inn i 3 Eppendorf-rør (1 ml hver), inkuber på is i 20 minutter, etterfulgt avsentrifugering ved 14000 rpm i 10 minutter til pellet kromatin. Kast supernatanten.
- Legg 0,8 ml 0,2 NH 2 SO 4 til hver kromatin pellet. Bruk en Eppendorf rør stampe dounce å slipe pellet godt til pellets er helt skilt. Inkuber prøvene på en roterende plattform ved 4 ° C over natten. Totale histoner er hentet med dette trinnet i syre behandling.
- Sentrifuger ved 14000 rpm i 10 minutter. Overfør supernatanten (histone utdrag) i to Eppendorf-rør (400 mL / tube). Kast pellet. Legg 2,5 volumer (1 ml) av iskald etanol i hvert rør .. Hold prøvene ved -20 ° C over natten.
- Sentrifuger ved 14000 rpm i 10 minutter til pelletskaminer totalt histoner, kast supernatanten. Vask pellet tre ganger med 70% EtOH, la på benken i 20-30 minutter for å lufttørke. Oppbevar de tørkede proteiner ved -80 ° C eller oppløse dem i DDH 2 O og fortsett til HPLC analyse umiddelbart. Tørkede proteiner kan lagres-80 ved ° C i opptil 1 år.
4. HPLC Analyse av Linker histoner
- Resuspender den histone pellet i den anbefalte mengden DDH 2 O, avhengig av kapasiteten omvendt fase kolonne og HPLC instrument. Vi bruker C18 omvendt fase kolonne 250 x 4,6 mm (Vydac) og Äktapurifier UPC 900 instrument (GE Healthcare) for HPLC analyse. Vi vanligvis oppløse 50-100μg av totalt histoner i 100 mL av DDH 2 0 for analyse.
- Sentrifuger ved 14000 rpm i 5 minutter for å fjerne uoppløselige rester. Bradford protein assay brukes til å bestemme mengden av protein som skal injiseres på kolonnen. Injiser 50-100 mikrogram total protein i omvendt fase kolonnen på HPLC system. Legge en overskytende beløp av protein bør unngås for å hindre tilstopping av kolonnen.
- Fraksjonerer dennes histoner og kjerne histoner med en økende acetonitril gradient som oppført i tabell 2.
Tabell 2. Økende acetonitril gradient over tid.
- Avløpsvannet overvåkes på 214 nm, og HPLC profiler (Figure 4) blir registrert og analysert ved hjelp Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) med UNICORN 5,11 programvare (GE Healthcare). De proteinfraksjoner kan også innhentes med brøkdelen auto-samleren (Frac-920 - GE) for videre analyse, f.eks SDS-PAGE og massespektrometri.
- A 214 verdier av toppene i hvert H1 subtype og H2B er normalisert med antall peptidbindinger i hvert tilsvarende histone protein. Den relative andel av individuelle H1 histone undergrupper innenfor H1 familien, samt som forholdet mellom H1 undertyper til nucleosome sentrale partikler kan beregnes fra disse normalisert A 214 verdier (figur 5).
5. Representative Resultater
Listen over pattedyr H1 undertyper, overordnet flytskjema og representative resultater av uttrykk analyse av individuelle histone H1 gener er vist i Tabell 1, Figur 1 og Figur 2-5, henholdsvis.Figur 2a viser typiske forsterkningsbehov kurver av H1A qPCR reaksjoner som bruker cDNA forberedt fra mus lever og mESCs, mens Figur 2B viser derivative smeltende kurvene til de tilsvarende amplikonene. Den smeltende kurven viser en enkelt egenskap topp på smeltetemperaturen (Tm) ved 86 ° C for H1A PCR fragment, og mangler ikke-spesifikke bakgrunn topper, tyder høy spesifisitet av H1A qPCR assay. Evaluering av forsterkning plottet (Figur 2A) viser at de tre eksemplarer qPCR reaksjonene til hvert utvalg ga konsistente signaler med nesten identiske Ct verdier, noe som tyder på høy reproduserbarhet. Mangelen på amplikonene bygge opp fra RT (-)-qPCR reaksjoner indikerer at genomisk DNA forurensning ikke var til stede, eller minimal. Utnytte Ct-verdier på H1 gener og rengjøring gener, for eksempel GAPDH, ble de relative RNA uttrykk nivåer av hver H1 gen beregnes. Eksempler på beregnede resultater for H1 ° og H1A gener er vist i Forskjellen i uttrykket for H1A eller H1 ° i mESC versus voksen mus leveren er også tydelig fra HPLC profiler av histonproteiner (figur 4). H1 °, differensiering spesifikk H1, er akkumulert til et stort beløp i modne vev, sto for 27,2% av total H1 i voksen leveren (Figur 5A). I kontrast er H1 ° protein nesten fraværende i udifferensierte mESCs (Figur 4B). På den annen side er H1A høyt uttrykt både i mRNA transkripsjoner og proteiner, i mESCs (figur 3 og 4B). Gjennom kvantifisering av H1 topper i HPLC profil, er den relative andelen av hver enkelt H1 subtype innenfor H1 familien bestemt (Figur 5A). Videre verdiene for individuell H1 subtype (ellertotal H1) per nucleosome kan beregnes ved forholdet mellom den normaliserte A 214 toppverdien av tilsvarende H1 undertyper (eller summen av total H1) til halvparten av den normaliserte A 214 verdier for H2B (Figur 5B). 
Figur 1. Generelle ordningen uttrykk analyse av pattedyr linker-histone subtyper. 
Figur 2. Representative resultatene av H1A qPCR assay. (A) Amplification tomt på H1A qPCR assay. Terskelen linjen og Ct-verdiene satt av IQ5 Optical System Software er indikert. (B) Derivater smelte-kurver av qPCR produkter som vises i (A). 
Figur 3. QRT-PCR analyse av mRNA nivåer av H1A og H1 ° i mESCs og voksen mOuse leveren. Y-aksen representerer relative uttrykk nivåer av H1 gener som for referansen genet GAPDH. qPCR med RT (-) prøver (RNA uten revers transkripsjon) viser minimale eller ingen signaler. 
Figur 4. HPLC analyse av histoner hentet fra mammalske celler. Reverse-fase HPLC analyse av 100 mikrogram total histoner hentet fra voksen mus leveren (A) og mus ESCs (B). X-aksen: eluering tid. Y-aksen: Mau, milli-absorpsjon enheter. 
Figur 5. H1 subtype sammensetning og H1 per nucleosome forholdstall i voksen mus leveren. A 214 verdiene i peak-området for hver H1 isoform og H2B beregnes UNICORN 5,11 programvare (GE Healthcare), og normalisert med antall peptidbindinger stede i tilsvarende histone protein. Summen av normalisert A214 verdier av alle H1 undertyper er innhentet som verdien for total H1. Andelen av totale H1 for hver H1 subtype (A), samt forholdet mellom H1 til nucleosome (representert ved halvparten av normaliserte A 214 verdier av H2B) (B) i voksen mus lever beregnes fra HPLC profilen vist i Figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Settet av analysene presenteres her gjør omfattende analyse av uttrykket nivåer av pattedyr dennes histone subtyper. Riktig utformet QRT-PCR-analyser gir svært følsomme og nøyaktige målinger av RNA meldinger fra noen pattedyr histone H1 gener. Den kritiske delen av Qrt-PCR-analyser for dennes histone SubType gener er utarbeidelsen av cDNA ved hjelp tilfeldig primer basert revers transkripsjon. mRNA av de fleste histone gener, inkludert de fleste H1 gener, inneholder ikke en lang poly-A hale presentert i andre cellulære mRNAs. Dermed tradisjonelle revers transkripsjon metoden med oligo-DT primere vil ikke effektivt produsere H1 cDNAs. Expression analyse av de få H1 gener med mRNA transkripsjoner inneholder poly-A hale, for eksempel H1 0, er like effektivt med tilfeldige heksamer basert QRT-PCR (figur 3), sannsynligvis på grunn av høy overflod av H1 RNAS. Likevel, en blanding av oligo-dT primere og de tilfeldige heksamer for RT reaksjonsjon kan bli vedtatt for å bedre RT effektivisere polyadenylated mRNA som er av lav kopiere numre, slik bredere dekning av gener analysert ved QRT-PCR. QRT-PCR av interne referanse gener, for eksempel husholdningsgenet GAPDH, er inkludert slik at den relative uttrykket nivået av spesifikke H1 gener på tvers av ulike vev eller celletyper kan sammenlignes (Figur 3). Ved å kombinere QRT-PCR med standard kurve analyse, er det også mulig å få absolutte kopiere numre av H1 cDNAs fra ulike prøver (data ikke vist).
Her kan vi også beskrive de protokoller for histone utvinning og HPLC analyse av histonproteiner. Fordelen med denne metoden er at man kan bestemme den relative andelen av hver H1 subtype innenfor pool av totalt H1 proteiner samt kvantifisere forholdet mellom individ H1 subtype (og total H1) per nucleosome. I tillegg, sammenlignet med andre protein analyse metoder, for eksempel Western blotting, HPLC analyse proforeskriver mer kvantitative og reproduserbar målinger av alle H1 subtyper. De forskjellige nivåene og sammensetningen av H1 subtyper i cellen modulere høyere orden kromatinstruktur. Forholdet mellom H1 til nucleosome har vist seg å korrelere med kromatin komprimering og er en determinant for nucleosome gjenta lengde i kromatin to. Derfor bør de metodene vi beskrevet her har brede programmer i kromatin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH stipend GM085261 og Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (til YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
