Summary
We beschrijven een reeks testen om de expressie niveaus van H1 linker histonen te analyseren. mRNA van de individuele H1 genen worden kwantitatief gemeten door een willekeurige primer op basis reverse transcriptie gevolgd door real-time PCR, terwijl eiwit kwantificering van H1 histonen wordt bereikt met behulp van HPLC-analyse.
Abstract
Linker histon H1 bindt aan de nucleosoom kerndeeltje en linker DNA, het vergemakkelijken van het vouwen van chromatine in de hogere orde structuur. H1 is essentieel voor zoogdieren ontwikkeling 1 en regelt genexpressie in vivo 2-4. Onder de sterk geconserveerde histon-eiwitten, de familie van de H1 linker histonen is de meest heterogene groep. Er zijn 11 H1 subtypes in zoogdieren die differentieel gereguleerd gedurende de ontwikkeling en in verschillende celtypen. Deze H1 subtypen behoren 5 somatische H1S (H1a-e), de vervanging H1 0, 4 kiemcel specifieke H1 subtypes, en H1x 5. De aanwezigheid van meerdere H1 subtypes die verschillen in het DNA bindingsaffiniteit en chromatine verdichting mogelijkheid 6-9 biedt een extra niveau van de modulatie van chromatine functie. Zo kwantitatieve analyse van individuele uitdrukking H1 subtypen, beide van mRNA en eiwit, is noodzakelijk voor een beter begrip van de regulering van hogereOm chromatine structuur en functie.
Hier beschrijven een aantal assays ontwikkeld voor het analyseren van de expressie van afzonderlijke subtypes H1 (figuur 1). opregulatie van verschillende H1 variant genen wordt gemeten door een aantal zeer gevoelige en kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) assays, die sneller en nauwkeuriger en vereisen minder monsters opzichte van de alternatieve benadering van Northern blot analyse. In tegenstelling tot andere cellulaire mRNA berichten mRNAs meeste histoon genen waarvan de meerderheid van genen H1, ontbreekt een lange polyA staart, maar bevatten een stam-lusstructuur aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) 10. Daarom worden cDNA's bereid uit totaal RNA door reverse transcriptie met random primers plaats van oligo-dT primers. Realtime PCR met primers specifiek voor elk H1 subtypes (Tabel 1) zijn uitgevoerd om zeer kwantitatieve meting van mRNA van de afzonderlijke H1 subtype verkrijgens. Expressie van housekeeping genen worden geanalyseerd als controle voor normalisatie.
De relatieve overvloed aan eiwitten van elk subtype H1 en de kern histonen wordt verkregen door middel van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) analyse van het totaal histonen uit zoogdiercellen 11-13. De HPLC-methode en elutie voorwaarden die hier worden beschreven voor een optimale scheiding van de muis H1 subtypes. Door het kwantificeren van de HPLC-profiel berekenen we het relatieve aantal afzonderlijke H1 subtypes binnen H1 familie en het H1 nucleosoom verhouding in de cellen te bepalen.
Protocol
1. Monstervoorbereiding en RNA-extractie
- Voor RNA-extractie, moeten alle gebruikte werkoppervlakken en pipetten worden afgenomen met 70% ethanol en behandeld met RNase decontaminatie oplossing, zoals RNase Zap. Deze werkwijze vermindert de kans RNase verontreiniging en RNA degradatie. Draag handschoenen voor alle procedures.
- Om RNA-extract van de muis weefsel, ontleden het orgel van de belangstelling van euthanized muis, en was het weefsel in ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM natriumfosfaat heptahydraat, 5 mM mononatriumfosfaat heptahydraat, pH 7,4) . Ga onmiddellijk extractie RNA in stap 1.4. Als sel niet worden verwerkt voor RNA-extractie moet het weefsel onmiddellijk module bevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij -80 ° C voor later gebruik.
- Indien RNA moet worden gewonnen uit aanhanger celkweek, aspireer cultuur media, spoelen met voldoende hoeveelheid PBS, en voeg Trizol reagens (vitrogen) op de plaat en ga verder met stap 1.4. Voor cellen gekweekt in suspensie oogsten de cellen en pellet cellen door centrifugeren. Gooi media, kort spoel de pellets met PBS, en de pellet de cellen met centrifugeren. Voeg Trizol Reagens en ga verder met stap 1.4.
- Voldoende Trizol Reagens vereist is om een hoge kwaliteit RNA. Gebruik 1 ml Trizol Reagens om RNA-extract 50 tot 100 mg weefsel, 5 - 10 x 10 6 cellen (voor de opschorting culturen) of per 3,5 cm plaat (voor hechtende culturen). Meng het weefsel in Trizol reagens met Polytron PT2100 homogenisator (of gelijkwaardig). Ga verder met RNA extraheren uit weefsel of cellen volgens de fabrikant de handleiding voor Trizol Reagens (Invitrogen).
- RNA concentratie gemeten met NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) en RNA kwaliteit wordt geanalyseerd door gelelektroforese. De typische opbrengstniveau 1-10 ug RNA per mg weefsel of 5-15 ug RNA per 1 x 10 6 gekweekte cellen. Om eliminerenmogelijke verontreiniging van RNA uit spoorhoeveelheid genomisch DNA worden RNA monsters behandeld met RNAse-vrij DNase (Sigma AMP-D1) volgens aanwijzingen van de fabrikant. Herhaal RNA-concentratie vastberadenheid en gel-elektroforese om geen afbraak van RNA te garanderen van deze behandeling. Store gehaald RNA bij -80 ° C.
* Opmerking: RNA kan worden geëxtraheerd met RNAeasy kit (Qiagen) volgens de kit handmatig of door DNA / RNA kit (Qiagen) indien beide DNA en RNA gewenst.
2. Kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR)
- Totaal RNA reverse getranscribeerd in cDNA met Superscript III eerste-streng-synthese (Invitrogen). Aangezien mRNA meeste H1 genen ontbreekt poly-A-staart, is het belangrijk om willekeurige hexameren plaats van oligo-dT als primers voor cDNA-synthese. Indien expressie analyse van genen met gepolyadenyleerde berichten op een laag niveau is eveneens gewenst, een mengsel van willekeurige hexameren en oligo-dT should worden gebruikt in de omgekeerde transcriptie (RT) reactie op de omgekeerde transcriptie efficiëntie van gepolyadenyleerde mRNA verbeteren.
- Voer de RT reactie volgens de handleiding. Kort
- In 0,5 ml PCR buis combineren 5 ug totaal RNA, 1 ul van 50 ng / pl willekeurige hexameren, 1 pi 10 mM dNTP mix en voeg DEPC-behandeld H2O de totale reactievolume als 10 pi maken. Mengen en incuberen gedurende 5 minuten bij 65 ° C, gevolgd door 1 minuut incubatie op ijs.
- Bereid 10 pi cDNA Synthesis Mix: 2 pi 10xRT buffer, 4 pi 25 mM MgCl2, 2 pi 0,1 M DTT, 1 pi RNaseOut (40 U / pl), 1 ul van SuperScript III RT (200 U / pl) en voeg deze toe aan / primer mengsel RNA.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C, gevolgd door 50 minuten bij 50 ° C en beëindigen van de reactie bij 85 ° C gedurende 5 minuten.
- Elke reactiezone levert typisch 100 tot 250 ng / ul cDNA product. Bewaren cDNA producten bij -20° C of ga direct voor real-time kwantitatieve PCR (qPCR).
- qPCR nauwkeurig kan kwantificeren van de doelsequentie kopieën met een hoog rendement en reproduceerbaarheid 14. We kiezen qPCR gemeten SYBR Green kleurstof, die een fluorescent signaal alleen wanneer het intercalates met dubbelstrengs DNA (dsDNA) geeft. Hoewel niet zo specifiek Taqman assay 14, deze methode is rendabeler en eenvoudiger aan te nemen in het laboratorium, en geeft meer veelzijdigheid qPCR. Daarom is het belangrijk om de amplificatie plot (Figuur 2A) en het derivaat smeltcurven de qPCR product (figuur 2B) onderzoeken reactie-efficiëntie en specificiteit te waarborgen.
| Histon subtypes | Muis histon nomenclatuur | Human histon nomenclatuur | ||
| Gene naam | Toetreding nee. | Gene naam | Toetreding nee. | |
| Histon H1a | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histon H1b | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histon H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histon H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histon H1E | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histon H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histon H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histon H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histon H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histon H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histon Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tabel 1. Histon H1-subtype nomenclatuur bij muis en mens.
- Ontwerp en achteruit PCR primers specifiek voor elk H1 gen (Tabel 1). Door de hoge sequentiegelijkenis onder somatische H1S, vooral in het gebied dat overeenkomt met de centrale bolvormige domein, is het essentieel dat de primers voor een specifieke H1 subtype niet uitgelijnd met other H1 genen, of cross versterken andere H1 subtypes. Het is ook belangrijk op te merken dat de meeste H1 genen geen introns bevatten. Zo intron-verspreid over primers meestal aangenomen voor RT-PCR op genomisch besmetting te voorkomen zijn niet beschikbaar. In plaats daarvan moet RNA monsters worden voorbehandeld met DNase (zie 1.5) voor een spoorhoeveelheid genomic vervuiling te voorkomen. Bovendien RT (-) te-qPCR worden uitgevoerd in parallel met het ontbreken van genomische verontreiniging in de cDNA-monsters te bevestigen.
- Ook ontwerp van primers voor interne referentie genen waarvan de expressie worden niet gewijzigd bij monsters. Vaak huishoudelijke genen, zoals glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) en bèta-actine-genen zijn gekozen als referentie genen. qPCR signalen van housekeeping genen dienen als normalisering controles.
- Bereid een PCR-reactie (totaal volume van 25 pi) als volgt: 12,5 ßl 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (die dNTPs, 50 U / ml ItaQ DNA polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I en 20nM fluoresceïne), 2 pi van 4 ng / ul cDNA, 1,25 ul van 10 nM vooruit / achteruit primer mix, en 9,25 ul van DDH 2 O, en meng goed in microseal 96-well PCR-plaat. Gebruik plakkende microseal 'B' (Bio-Rad), zodat de plaat deksel afgesloten de plaat. Kort Tik of vortex de PCR-plaat, en spin down de reactie mengsels door een korte centrifugeren. Plaats de plaat in MyIQ Een kleur real-time PCR Detection System (Bio-Rad) voor qPCR.
- Wij de volgende qPCR voorwaarden: 95 ° C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden 60 ° C gedurende 20 seconden 72 ° C gedurende 30 seconden. Onderzoek de versterking curven (figuur 2A) voor PCR-efficiëntie en Ct (drempel van de cyclus) waarden. De drempel lijn kan automatisch worden ingesteld door de IQ5 Optical System Software versie 2.0.
- De primer efficiëntie en optimale concentratie die nodig cDNA kan worden getest door een standaard curve assay, waarbij een verdunning van genomisch DNA is gebruikt voor qPCR en Ct-waarden worden uitgezet tegen log van template-DNA bedrag. Een geoptimaliseerde qPCR assay met primers van hoge specificiteit en efficiëntie geeft een lineaire standaardcurve, met de determinatiecoëfficiënt (R 2)> 0,98. Voorkom primers met amplicon lengte van meer dan 200 bp, die meestal slecht amplificatie efficiëntie.
- Omdat SYBR Green detecteert dsDNA, is het essentieel om een smeltcurve run na de qPCR om ervoor te zorgen dat de gewenste amplicon, maar niet primer dimeren of verontreiniging bevatten, worden versterkt en gedetecteerd uit te voeren. Voor smelt-curve analyse programma qPCR instrument de monsters verwarmen van 55 ° C tot 95 ° C in 0,5 ° C stappen met gegevensverzameling. De standaardinstelling smelt-curve analyse voor MyIQ (Bio-Rad) instrument is de volgende: 95 ° C gedurende 1 minuut, 55 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door 81 cycli van 10 seconden bij 55 ° C gewenste smelten curve + temp 0,5 ° C (camera verzamelt gegevens bij elke cyclus).
- Sinds smelttemperatuur (Tm) van dsDNA is afhankelijk amplicon lengte GC-gehalte, zullen verschillende amplicons verschillende Tm (s). Onderzoek afgeleide smeltcurven de qPCR producten aan de specifieke smelttemperatuur gewenste amplicons en het ontbreken van ruis amplicon pieken (Figuur 2B) te bevestigen.
- Bereid twee-of drievoud reacties voor elke assay voor statistische analyse. Voeg negatieve controles voor qRT-PCR zoals RT (-)-qPCR (qPCR met RNA als templaat zonder reverse transcriptie) en qPCR zonder cDNA, RNA of DNA bron toegevoegd in de PCR-mix. RT (-)-qPCR kan dienen als controle voor mogelijke genomisch DNA verontreiniging (RT (-) in figuur 2 en 3).
- Analyseer qPCR gegevens met IQ5 Optical System Software versie 2.0 (Bio-Rad). Normaliseren de uitdrukking waarden van H1 isovorm genen met de expressie van huishoudelijke gen (bv. GAPDH, ß-actine, HPRT) om de relatieve expressie van H1 genen te verkrijgen.
* Alle procedures worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.
- Ontleden muis weefsel en spoel het met ijskoude PBS. (Indien niet begeef u onmiddellijk naar extractie, snap bevriezen en bewaren van de monsters als beschreven in stap 1.2.) Hak het weefsel in stukken met een scheermesje. Overdracht gehakt om een Dounce homogenisator (B stamper). Voeg 10 ml Sucrose buffer (0,3 M sucrose, 15 mM NaCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, Complete Mini Proteaseremmer Cocktail Tablet toevoegen vers) per gram weefsel. Meng het weefsel met 10-15 slagen.
- Breng de homogenaten om een 15 ml buis, draaien op 500 rpm gedurende 30 seconden (centrifuge model: Eppendorf 5810R), dus wees het supernatant over te dragen aan een nieuwe buis (gooi de pellet-weefselstukjes), en gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 5 minuten, tot pellet cellen. Ga verder naar stap 3.4.
- Als histonen en chromatine moeten worden geëxtraheerd uit de cellen gekweekt in monolaag, spoelmet PBS, voeg PBS om de cultuur schotel, en het oogsten van de cellen met behulp van cel-schraper, en pellet cellen door centrifugeren. Voor cellen gekweekt in suspensie pellet cellen door centrifugeren.
- Resuspendeer de celpellet in 10 ml buffer Sucrose aangevuld met 0,5% NP-40 (per gram weefsel vanaf hoeveelheid of 10 (8) cellen). Breng het monster op een Dounce homogenisator (B stamper) en Dounce 10 slagen binnen 20 minuten incubatie. Op dit moment zijn kernen verkregen. Onderzoek de kernen kwaliteit onder een microscoop. Pellet de kernen door centrifugatie bij 2000 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de kernen pellet in 3 ml buffer met hoog zoutgehalte (0,35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF - vers toevoegen vóór het gebruik) per 1 g weefsel of 10 (8) cellen. Breng het monster tot een kleine Dounce homogenisator (B stamper) en homogeniseer met 5-10 slagen.
- Aliquot de suspensie in 3 Eppendorf buizen (1 ml), incuberen op ijs gedurende 20 minuten, gevolgd doorcentrifugeren bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten pellet chromatine. Verwijder het supernatant.
- Voeg 0,8 ml 0,2 NH2 SO 4 elk chromatine pellet. Gebruik een eppendorfbuisje stamper Dounce om goed te slijpen de korrel tot de pellet volledig gescheiden. Incubeer de monsters op een draaiplateau bij 4 ° C geroerd. Totaal histonen geëxtraheerd met deze stap zuurbehandeling.
- Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten. Breng de bovenstaande (histon uittreksels) in twee Eppendorf buizen (400 ul / buis). Gooi de pellet. Voeg 2,5 volumes (1 ml) ijskoude ethanol aan elke buis .. Bewaar de monsters bij -20 ° C gedurende de nacht.
- Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten op pellet totaal histonen, gooi het supernatant. Was de pellet drie keer met 70% EtOH, laat op de bank voor 20-30 minuten aan de lucht drogen. Bewaar de gedroogde eiwitten bij -80 ° C of ontbinden in DDH 2 O en onmiddellijk tot HPLC analyse. Gedroogde eiwitten kunnen worden opgeslagenbij -80 ° C gedurende 1 jaar.
4. HPLC-analyse van de Linker histonen
- Resuspendeer de histoon pellet in de aanbevolen hoeveelheden DDH 2 O afhankelijk van de capaciteit van omgekeerde fase HPLC kolom en de instrument. We maken gebruik van C18 omgekeerde fase kolom 250 x 4,6 mm (Vydac) en Äktapurifier UPC 900 instrument (GE Healthcare) voor HPLC-analyse. We gewoonlijk los 50 100μg totale histonen in 100 ul DDH 2 0 voor analyse.
- Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten om onoplosbare resten te verwijderen. Bradford eiwit assay gebruikt om de hoeveelheid eiwit worden geïnjecteerd op de kolom te bepalen. Injecteer 50-100 ug totaal eiwit in de omgekeerde fase HPLC kolom systeem. Laden van een grote hoeveelheid eiwitten moet worden vermeden om verstopping van de kolom te voorkomen.
- Fractioneren linker histonen en histonen kern met toenemende gradiënt acetonitril als vermeld in tabel 2.
Tabel 2. Het verhogen van acetonitril verloop in de tijd.
- Het afvalwater wordt gecontroleerd bij 214 nm, en de HPLC-profielen (Figure 4) worden geregistreerd en geanalyseerd met behulp van Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) met UNICORN 5.11 software (GE Healthcare). Het eiwit fracties kunnen ook verzameld worden met de fractie auto-collector (Frac-920 - GE) voor verdere analyse, zoals SDS-PAGE en massaspectrometrie.
- De A 214 waarden van de pieken van elke H1 subtype en H2B worden genormaliseerd door het aantal peptidebindingen van telkens histoneiwit. De relatieve verhoudingen tussen de afzonderlijke H1 histon subtypes binnen de familie H1, alsmede de verhouding van H1 subtypes aan nucleosome kerndeeltjes kan worden berekend uit deze genormaliseerde A 214 waarden (Figuur 5).
5. Representatieve resultaten
De lijst van zoogdieren H1 subtypen algemeen stroomschema en representatieve resultaten van de expressie analyse van individuele histon H1 genen zijn weergegeven in tabel 1, figuur 1 en figuur 2.5 resp.Figuur 2A toont typische versterking rondingen van H1a qPCR reacties met behulp van cDNA bereid uit muizen lever en mESCs, terwijl figuur 2B toont de afgeleide smelten rondingen van de overeenkomstige amplicons. De smeltcurve toont een karakteristieke piek bij smelttemperatuur (Tm) bij 86 ° C voor de PCR amplicon H1a, en geen niet-specifieke achtergrond pieken suggereert hoge specificiteit van H1a qPCR assay. Evaluatie van de versterking plot (Figuur 2A) toont aan dat de drievoud qPCR reacties van elk monster consistente signalen gaven met bijna identieke Ct-waarden, hetgeen wijst op een hoge reproduceerbaarheid. Het ontbreken van amplicons opbouw van RT (-)-qPCR reacties blijkt dat genomisch DNA verontreiniging niet aanwezig was, en minimaal. Gebruik makend van de Ct-waarden van H1 genen en het huishouden genen, zoals GAPDH, werden de relatieve RNA expressie niveaus van elke H1 gen berekend. Voorbeelden van berekende resultaten voor H1 ° en H1a genen worden getoond in Het verschil in expressie van H1a of H1 ° in mES ten opzichte van volwassen muizen lever blijkt ook uit HPLC-profielen van histon-eiwitten (figuur 4). H1 ° de differentiatie specifieke H1, wordt geaccumuleerd om een grote hoeveelheid in volwassen weefsels goed voor 27,2% van de totale H1 in volwassen lever (figuur 5A). Daarentegen H1 ° eiwit nauwelijks in ongedifferentieerde mESCs (Figuur 4B). Anderzijds wordt H1a sterk tot expressie, zowel in mRNA transcripten en eiwitten in mESCs (figuur 3 en 4B). Door middel van kwantificering van H1 pieken in de HPLC-profiel, wordt het relatieve aandeel van elk individu H1 subtype binnen de H1 familie bepaald (figuur 5A). Bovendien is de waarde van de afzonderlijke H1 subtype (oftotale H1) per nucleosome kan worden berekend uit de verhouding van de genormaliseerde A 214 piekwaarde overeenkomstige H1 subtypes (of de som van de totale H1) de helft van de genormaliseerde A 214 waarden H2B (figuur 5B). 
Figuur 1. Algemeen schema van expressie analyse van zoogdieren linker-histon-subtypes. 
Figuur 2. Vertegenwoordiger resultaten van H1a qPCR test. (A) Versterking perceel van H1a qPCR test. De drempel lijn en Ct-waarden die de IQ5 Optical System Software worden aangegeven. (B) Afgeleide smelt-curven van qPCR producten in (A). 
Figuur 3. QRT-PCR analyse van mRNA niveaus H1a en H1 ° mESCs en volwassen mouse lever. Y-as geeft de relatieve expressieniveaus van H1 genen die van de referentie-gen GAPDH. qPCR met RT (-) monsters (RNA zonder reverse transcriptie) toont weinig of geen signalen. 
Figuur 4. HPLC analyse van histonen uit zoogdiercellen. Omgekeerde fase HPLC analyse van 100 ug totaal histonen uit volwassen muizenlever (A) en muizen SER (B). X-as: elutietijd. Y-as: MAU, milli-absorptie-eenheden. 
Figuur 5. H1 subtype samenstelling en H1 per nucleosoom ratio's bij volwassen muis lever. De A 214 waarden van het piekoppervlak voor elke H1 isovorm en H2B worden berekend UNICORN 5,11 software (GE Healthcare) en genormaliseerd door het aantal peptidebindingen in de overeenkomstige histoneiwit. De som van genormaliseerde A214 waarden van alle H1 subtypes wordt verkregen zijn totale H1. Het percentage van de totale H1 per H1 subtype (A) en de verhouding van H1 tot nucleosome (voorgesteld door de helft van de genormaliseerde A 214 waarden H2B) (B) in volwassen muizenlever worden berekend uit de getoonde profiel HPLC figuur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De set van testen die hier in staat stellen een uitgebreide analyse van de expressie niveaus van zoogdieren linker histon subtypes. Goed ontworpen qRT-PCR testen leveren zeer gevoelige en nauwkeurige metingen van RNA-boodschappen van alle zoogdieren histon H1 genen. De kritische deel van qRT-PCR assays voor linker histon-subtype genen is de voorbereiding van cDNA met behulp van willekeurige primer op basis reverse transcriptie. mRNA meeste histon genen waaronder de meeste H1 genen bevatten geen lange poly-A staart die in andere cellulaire mRNAs. Dus de traditionele reverse transcriptie methode oligo-dT primers niet op efficiënte wijze H1 cDNA. Expressie analyse van de weinige H1 genen mRNA transcripten die poly-A staart zoals H1 0 even effectief willekeurige hexameren gebaseerd qRT-PCR (figuur 3), waarschijnlijk vanwege de hoge overvloed van H1 RNAs. Niettemin kan een mengsel van oligo-dT primers en de willekeurige hexameren voor RT reacrelevante informatie kan worden aangenomen om RT efficiëntie van gepolyadenyleerde mRNA's die van laag kopie-aantallen, waardoor een bredere dekking van de genen geanalyseerd door qRT-PCR te verbeteren. qRT-PCR interne referentie genen, zoals huishouding gen GAPDH, zodanig opgenomen, dat de relatieve expressie van specifieke genen H1 in verschillende weefsels of celtypen te vergelijken (figuur 3). Door qRT-PCR met standaard curve analyse is het ook mogelijk om absolute aantal kopieën van H1 cDNA verkrijgen van verschillende monsters (data niet getoond).
Hier hebben we ook een beschrijving van de protocollen voor histon extractie en HPLC-analyse van de histon-eiwitten. Het voordeel van deze methode is dat men de relatieve hoeveelheden van elk H1 subtype bepalen binnen de pool van de totale H1 eiwitten en de verhouding van de individuele H1 subtype (en totale H1) per nucleosoom kwantificeren. In vergelijking met andere eiwitten analysemethoden, zoals Western blotting de HPLC-analyse provides meer kwantitatieve en reproduceerbare meting van H1 subtypes. De verschillende niveaus en de samenstelling van H1 subtypes in de cel moduleren hogere orde chromatine structuur. De verhouding van H1 tot nucleosome is aangetoond dat zij met chromatine verdichting en bepalend is voor nucleosoom herhaallengte in chromatine 2. Daarom moet de methoden die we hier beschreven hebben een brede toepassingen in chromatine onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie GM085261 en Georgië Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (tot YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
