क्लीनिकल एंटीबॉडी नमूने के Phagocytic गतिविधि निर्धारण

Summary

हम उच्च throughput प्रवाह cytometric परख वर्तमान नैदानिक ​​नमूनों से प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी की phagocytic गतिविधि का निर्धारण, फ्लोरोसेंट प्रतिजन में लिपटे माला और एक monocytic सेल लाइन में एकाधिक एफसी व्यक्त उपयोग रिसेप्टर्स – प्रदान रिसेप्टर उपयोग और phagocytic गतिविधि determinations में एक मानकीकृत और ब्याज की किसी भी प्रतिजन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन.

Abstract

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination^1-3.

Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 297^4-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.

Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis⁷. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response⁸.

Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 μm fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple FcγRs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of FcγRs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection⁹.

Protocol

1. संस्कृति Phagocytic कोशिकाओं संस्कृति – THP १६४० RPMI में एक 10 कोशिकाओं टी बोतल में एक स्थिर निलंबन के रूप में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक है. सेल घनत्व 6 / 0.5×10 एमएल नीचे FcγR अभिव्यक्ति और परख प्रदर्शन के अनुरूप स्तर बनाए रखने के क्रम में बनाए रखा जाना चाहिए. 2. Biotinylated एंटीजन तैयार Sulfo एनएचएस नियंत्रण रेखा बायोटिन अभिकर्मक के निर्माता के निर्देशों के अनुसार ब्याज के लक्ष्य प्रतिजन biotinylate के लिए आवश्यक किट की राशि की गणना. पानी में biotinylation अभिकर्मक भंग और तुरंत कि प्राथमिक amines शामिल नहीं करता है एक बफर में प्रतिजन के लिए राशि की गणना जोड़ने. प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए, कभी कभी मिश्रण की अनुमति दें. बफर आदान प्रदान से एक उपयुक्त आणविक वजन cutoff के लिए एक Amicon केन्द्रापसारक एकाग्रता इकाई में अतिरिक्त, unconjugated बायोटिन targe बनाए रखने के लिए निकालेंटी प्रतिजन. एकाग्रता इकाई के शीर्ष कक्ष के लिए नमूना जोड़ें और 15 एमएल भरण लाइन अप करने के लिए कुल मात्रा लाने पीबीएस जोड़ने. 4000 XG पर अपकेंद्रित्र मात्रा लगभग 1.5 mls करने के लिए नीचे लाने के. इस प्रक्रिया को दोहरा मुक्त बायोटिन की दो बार 99% को दूर करने के लिए मोती प्रतिजन के अधिक से अधिक कोटिंग सुनिश्चित करेगा. 3. एंटीजन संतृप्त मोती तैयार 1 मिमी फ्लोरोसेंट neutravidin मोतियों की 100 μl 1 में दो बार धो मिलीलीटर 0.1% PBS-BSA उच्च गति से एक microcentrifuge में नीचे कताई के बाद. Resuspend 100 μl PBS-BSA, और विभाज्य में 10 ट्यूब में मोती धोया. प्रतिजन कोटिंग शर्तों जो मोती तर का निर्धारण करने के लिए, दो गुना चरणों में biotinylated प्रतिजन की सांद्रता varying के साथ धोया मनका निलंबन का 10 उल गठबंधन. 4 ° C में रातोंरात एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर microcentrifuge ट्यूब में सेते हैं. नोट:: मोतियों की संतृप्ति प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. यह पूरा किया जा सकता हैमनका कोटिंग की स्थिति है कि अधिक से अधिक phagocytosis उपज जब मोती बाद में एक नियंत्रण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ opsonized हैं की पहचान के द्वारा. जब तक मोती pelleted हैं पीबीएस 1-BSA एमएल और उच्च गति से अपकेंद्रित्र के साथ धोने से अनबाउंड प्रतिजन निकालें. पीबीएस-BSA निकालें और दोहराने. पीबीएस-BSA में 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में Resuspend लेपित प्रतिजन मोती. मोती के लिए भंडारित किया जा सकता है है 4 ° सी से पहले का उपयोग करने के लिए एक सप्ताह के लिए. 4. एंटीबॉडी नमूने तैयार क्लीनिकल एंटीबॉडी नमूने प्लाज्मा निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एक तरबूज जेल आईजीजी शुद्धि किट का उपयोग कर से शुद्ध किया जा सकता है है. शुद्ध आईजीजी 4 बजे ° उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक सी संग्रहीत किया जा सकता है. नोट: उचित सावधानियों मानव नमूनों से निपटने के बारे में हमेशा से लिया गया होगा. Absorbance के द्वारा A280 पर एंटीबॉडी शुद्ध एकाग्रता का निर्धारण, और 1 / पीबीएस में मिलीग्राम मिलीलीटर नमूने पतला. मंज़ूर तैयारive और 1 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर के लिए कमजोर पड़ने से नकारात्मक यह मोनोक्लोनल नियंत्रण एंटीबॉडी. 5. प्रयोग चढ़ाना धोया, प्रतिजन संतृप्त मनका ऊपर vortexing द्वारा तैयार समाधान Resuspend, और एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह में 10 μl हस्तांतरण. देखभाल के लिए लगातार मनका निलंबन आंदोलन फ्लोरोसेंट मोतियों के बराबर संख्या सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए रहे हैं एक अच्छी तरह से जोड़ा. एंटीबॉडी के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ब्याज की सांद्रता varying प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक खुराक – प्रतिक्रिया वक्र बनाने जोड़ें. इष्टतम सांद्रता उपस्थित एंटीबॉडी के अनुमापांक के आधार पर नमूनों के बीच अलग है, लेकिन 0.01-100 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता की एक सीमा अच्छा कवरेज प्रदान करते हैं और ब्याज की एकाग्रता रेंज की पहचान की अनुमति देगा. सुनिश्चित एंटीबॉडी कोई 20 μl से बड़ी मात्रा में जोड़ रहे हैं. सेते हैं और 37 से कम 2 घंटे के लिए मोती एंटीबॉडी नमूनों डिग्री सेल्सियस एंटीबॉडी मोती opsonize के लिए अनुमति देने के लिए./ Li> 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर THP-1 कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी, और x 5 की कुल के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से इस निलंबन के 200 μl जोड़ने THP 10 4 1 में एक अच्छी तरह कोशिकाओं . 37 पर रात में सेते ° सी, 5%, सीओ 2 एक स्थिर इनक्यूबेटर में, अनुमति कोशिकाओं और गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से मोती गोली. नोट: शोर करने के लिए सिग्नल इष्टतम मनका निर्धारण द्वारा सुधार किया जा सकता है: प्रतिरक्षी: THP दिया प्रतिजन और एंटीबॉडी स्रोत के लिए एक सेल अनुपात. 6. फ्लो Cytometric विश्लेषण प्रत्येक अच्छी तरह से सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा से सतह पर तैरनेवाला के 100 μl निकालें. सतह पर तैरनेवाला अगर cytokine स्राव determinations या अन्य विश्लेषण वांछित हैं बचाया जा सकता है. निर्धारण के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से और pipet करने के लिए 4% paraformaldehyde के 100 μl जोड़ने resuspend और कोशिकाओं का मिश्रण है. उच्च throughput प्रवाह cytometric विश्लेषण बी.डी. LSR द्वितीय एक HTS प्लेट रीडर के साथ सुसज्जित का उपयोग किया जा सकता है है. प्रोग्राम सॉफ्टवेयर एक अच्छी तरह तीन बार (100 μl मिश्रण की मात्रा) का मिश्रण करने के लिए और 30 μl, या प्रत्येक नमूने के कम से कम 2000 सेल घटनाओं का विश्लेषण. डेटा एकत्र FlowJo या समकक्ष सॉफ्टवेयर में विश्लेषण किया जा सकता है. उपयोगी मैट्रिक्स मनका + प्रतिशत है, या फ्लोरोसेंट कोशिकाओं,, जो phagocytic मौजूद कोशिकाओं की संख्या का एक उपाय प्रदान करता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से phagocytic कोशिकाओं है, जो phagocytosed मनकों की संख्या का एक उपाय प्रदान करता है प्रतिदीप्ति तीव्रता शामिल हैं. इन मूल्यों गुणा एक एकीकृत मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता, या iMFI उत्पन्न करता है. प्रत्येक phagocytic सेल द्वारा phagocytosed मोतियों की औसत संख्या 1 मनका के मतलब प्रतिदीप्ति द्वारा iMFI विभाजित करके गणना की जा सकती है. 7. प्रतिनिधि परिणाम वहाँ प्रभावित और अप्रभावित विषयों से एंटीबॉडी नमूनों की स्पष्ट भेदभाव किया जाना चाहिए. चित्रा 1A एचआईवी nega से एक एंटीबॉडी नमूना के FACS histograms प्रस्तुत(काला ट्रेस) सक्रिय और एक एचआईवी सकारात्मक (ग्रे ट्रेस) विषय, और वृद्धि की प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति द्वारा संचालित phagocytosis को दर्शाता है. परख की संवेदनशीलता इष्टतम biotinylated प्रतिजन के साथ मोती की संतृप्ति पर निर्भर है. चित्रा 1 बी मनाया जब प्रतिजन के भिन्न मात्रा के साथ लेपित मोती 3 नियंत्रण (एक गैर बाध्यकारी एंटीबॉडी, त्रिकोण सहित) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ opsonized थे phagocytosis प्रस्तुत करता है, और इस प्रतिजन के लिए एक saturating एकाग्रता 2μg प्रतिजन / μl मोती के रूप में स्थापित है. एक खुराक – प्रतिक्रिया वक्र चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है, और विषय एंटीबॉडी नमूने के अंतर की क्षमता दर्शाता है 0.05-5 μg / मिलीलीटर की एक एंटीबॉडी एकाग्रता सीमा पर phagocytosis प्रेरित है. इस अंतर phagocytosis अनुमापांक या एफसी आईजीजी उपवर्ग और ग्लाइकोसिलेशन राज्य जैसे डोमेन गुणों में या तो मतभेद के द्वारा संचालित किया जा सकता है. जब THP-1 कोशिकाओं मैं कर रहे हैंMaged फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा, वहाँ मनका phagocytosis के स्पष्ट सबूत है. चित्रा 3 दो 63x अभी भी प्रतिरक्षी opsonized (हरा) और गैर opsonized मोती (लाल) के साथ ऊष्मायन के बाद THP-1 कोशिकाओं की छवियों प्रस्तुत करता है, एंटीबॉडी के अभाव में phagocytic तेज की कमी का प्रदर्शन. जब समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया है, एंटीबॉडी विशिष्ट फ्लोरोसेंट मोतियों की phagocytic तेज और भी अधिक हड़ताली (1 मूवी, 20x बढ़ाई) है. पिछले काम कोशिकाओं के साथ जुड़े मोतियों की internalization पुष्टि की है, और प्राथमिक monocytes प्रयोगों के साथ अच्छी तरह से phagocytic स्कोर (iMFI मान) के साथ इस उच्च throughput परख (नहीं दिखाया डेटा है) में सहमति व्यक्त की है. चित्रा 1 परख गुणवत्ता नियंत्रण. 1A, फ्लो phagocytosis की एक एचआईवी नकारात्मक (काले ट्रेस) विषय और एक एचआईवी पॉजिटिव विषय (ग्रे ट्रेस) से एक एंटीबॉडी नमूना के लिए cytometry histograms.1B: एक नमूना प्रतिजन के लिए इष्टतम मनका कोटिंग शर्तों के प्रायोगिक दृढ़ संकल्प. एंटीजन – विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (वृत्त, वर्ग) μg> 2 मोतियों की प्रतिजन / μl के साथ लेपित मोतियों की अधिक से अधिक phagocytosis प्रदर्शित है, जबकि एक नियंत्रण एंटीबॉडी (त्रिकोण) कोई phagocytic गतिविधि को दर्शाता है. चित्रा phagocytosis 2. खुराक – प्रतिक्रिया वक्र. एचआईवी पॉजिटिव (इलाज, इलाज, और विरोधी retroviral चिकित्सा के अभाव में वायरल प्रतिकृति के नियंत्रण का प्रदर्शन) और एचआईवी gp120 के नकारात्मक विषयों ड्राइव phagocytosis (एचआईवी लिफाफा) लिपटे मोतियों के विभिन्न प्रकार से क्लीनिकल एंटीबॉडी नमूने. चित्रा 3 कुशल internalization. माइक्रोस्कोपी एंटीबॉडी opsonized मोती (हरा) के internalization पुष्टि, जबकि गैर opsonized मोती प में रहते हैंution (63x बढ़ाई). मूवी 1. एंटीबॉडी संचालित phagocytosis के समय चूक माइक्रोस्कोपी 14 घंटे के कोर्स पर प्रदर्शन किया था और THP-1 उच्च throughput परख में उपयोग कोशिकाओं की phagocytic गतिविधि के दृश्य की अनुमति देता है. ग्रीन फ्लोरोसेंट मोती opsonized एंटीबॉडी कर रहे हैं, लाल फ्लोरोसेंट मोती एक नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करते हैं. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

परख यहाँ वर्णित एक monocytic सेल लाइन लंबे समय के लिए phagocytic ¹⁰ प्रक्रियाओं और प्लेट आधारित स्वचालित प्रवाह cytometry अध्ययन के लिए उपयोग का उपयोग करके चिकित्सीय एंटीबॉडी नमूनों की phagocytic गतिविधि का उच्च throughput विश्लेषण की अनुमति देता है. इस परख ठीक विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षी सबसेट विशेषताएँ करने की क्षमता में दूसरों से अधिक फायदेमंद है, phagocytosis में मतभेद रोग विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा संचालित विभिन्न विषयों से अध्ययन के लिए न केवल अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक ही विषय के भीतर एकाधिक प्रतिजन specificities के अध्ययन है. क्योंकि जन्मजात effector कोशिकाओं, monocytes और अन्य प्रतिजन कोशिकाओं पेश सहित एंटीबॉडी भर्ती जोरदार रोग ^11-13 परिणाम प्रभावों, और जैविक चर Asparagine297 एफसी डोमेन ^14-16 के एंटीबॉडी ज्यामिति, आईजीजी उपवर्ग, और ग्लाइकोसिलेशन निर्भर करता है, इस पद्धति के लिए प्रदान करता है कार्रवाई का एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षी तंत्र का मूल्यांकन. इसके अलावा, एंटीबॉडी दवा क्योंकि^7,17,18 संक्रमण के दौरान पैदा phagocytosis कुछ रोगजनकों द्वारा शोषण किया जाता है, इस परख एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि की प्रक्रिया के मूल्यांकन में वादा रखती है, और एक संभावित सुरक्षा, के रूप में अच्छी तरह के रूप में संभावित हानिकारक के रूप में phagocytosis की दोहरी प्रकृति पर प्रकाश डाला गया एंटीबॉडी गतिविधि.

वर्णित परख रोगी आबादी के नैदानिक ​​नमूनों से एंटीबॉडी का विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है है, लेकिन यह भी vaccinees की बजाय शुद्ध आईजीजी सीरम का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, phagocytosis के जवाब में cytokine स्राव संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से विश्लेषण किया जा सकता है, और विशिष्ट FCR के प्रभाव FCR अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग, phagocytic शक्ति में न केवल मतभेदों को निर्धारित किया जा अनुमति के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है, लेकिन बहाव घटनाओं अंतर्दृष्टि के साथ, संकेत तंत्र में, और हल करने और इस प्रतिरक्षा तंत्र की समझ को परिष्कृत करने में मदद कर सकते हैं.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit	Thermo Scientfic	21935
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane	Millipore	UFC905024	Filter unit size may vary according to antigen size
FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8776	Manufacturers produce this product in various colors
Melon Gel IgG Purification Kit	Thermo	45212	Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page.