Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Published: May 27, 2012 doi: 10.3791/3599
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

Summary

متعددة للبحث عن المفقودين الهدف هو خوارزمية محلية الصنع وضعت لتتبع الجزيئات بشكل فردي وصفت داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. كشف بكفاءة، وتقدير وتعقب جزيئات مع مرور الوقت في كثافة عالية توفر سهل الاستعمال، وأداة شاملة للتحقيق في ديناميات غشاء النانو.

Abstract

هدفنا هو الحصول على وصف شامل لعمليات الجزيئية التي تحدث في الأغشية الخلوية في الوظائف البيولوجية المختلفة. ونحن نهدف إلى تحديد خصائص منظمة معقدة وديناميكية من غشاء البلازما في مستوى واحد جزيء، من خلال تطوير أدوات تحليلية واحدة مخصصة لتتبع الجسيمات (SPT) في كثافة عالية: الهدف متعددة للبحث عن المفقودين (MTT) 1. واحدة جزيء videomicroscopy، وتقدم ميلي ثانية واحدة وقرار النانومترية 1-11، يسمح لتمثيل مفصل لمنظمة غشاء 12-14 بدقة عن طريق تعيين واصفات مثل مستقبلات الخلايا التوطين، والحبس، والتنقل أو التفاعلات.

نحن النظر SPT، على حد سواء بالتجربة وحسابيا. وشملت الجوانب التجريبية تحسين الإعداد ووسم الخلية، مع التركيز بشكل خاص على الوصول إلى كثافة العلامات أعلى مستوى ممكن، من أجل توفير لقطة الحيوية للديناميات الجزيئية 1ق يحدث داخل غشاء. المعنية بقضايا حسابي كل خطوة تستخدم لإعادة بناء مسارات: قمم الكشف، وتقدير وإعادة الاتصال، التي تناولتها وسائل محددة من تحليل الصور 15،16. تنفيذ الانكماش بعد اكتشاف يسمح قمم انقاذ مخبأة في البداية من قبل القمم، أقوى المجاورة. من المذكرة، وتحسين الكشف يؤثر تأثيرا مباشرا لإعادة الاتصال، عن طريق تقليل الفجوات في المسارات. وقد تم تقييم العروض باستخدام مونتي كارلو محاكاة لكثافة العلامات المختلفة والقيم الضجيج، والتي تمثل عادة القيود الرئيسيتين لقياسات موازية في القرار المكانية العالية.

يمكن للدقة النانومترية 17 التي تم الحصول عليها عن الجزيئات واحدة، وذلك باستخدام إما المتعاقبة على / قبالة البصريات photoswitching أو غير الخطية، وتقديم الملاحظات شاملة. هذا هو أساس أساليب nanoscopy 17 مثل STORM 18، 19،20 النخيل، RESOLFT 21 أو STED 22،23، مبادرة الخوذ البيضاءقد الفصل غالبا ما تتطلب عينات التصوير الثابت. المهمة المركزية هي الكشف وتقدير من الحيود محدودة القمم الصادرة عن جزيئات واحدة. وبالتالي، توفير افتراضات كافية مثل التعامل مع دقة ثابت الموضعية بدلا من الحركة البراونية، هي مناسبة بشكل مباشر MTT لتحاليل نانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم أساسا MTT بأي مقياس: ليس فقط لجزيئات، ولكن أيضا لخلايا أو الحيوانات، وعلى سبيل المثال. وبالتالي، MTT هو خوارزمية تتبع القوية التي تجد تطبيقات في موازين الجزيئي والخلوي.

Protocol

في هذا الفيديو، نقدم كامل تتبع جسيم واحد تجربة، وذلك باستخدام الكم النقاط التي تستهدف مستقبلات غشاء محدد. والهدف الرئيسي من هذه التجربة تتمثل في أنواع مختلفة من السلوكيات التي تميز الانتشار الجزيئي تقاس داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. في الواقع، يمكن للحركات الجزيئية التي تنشأ في الغشاء يخرج عادة من نشر البراونية التي يجري توجيه خطي أو محصورة داخل nanodomains 26-29، على سبيل المثال. ونحن نهدف في بعد واحد كما مستقبلات عدد ممكن من الناحية التقنية، لتوفير لقطة من مجموعة متنوعة الناشئة في الديناميات التي تحدث داخل غشاء الخلية الحية. ومن المتوقع في نهاية المطاف هذا للسماح للآليات فك رموز تنظيم مستقبلات الخلايا مما يشير الى السطح.

1. خلية ثقافة

  1. تحضير العينة الخلوية: استخدام تمسكا COS-7 الخلايا التي تعبر عن التطور الطبيعي للمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) 30. عندماالعمل مع الخلايا الحية دون المضادات الحيوية للتأكد من ليس لديهم كامنة دون كشف التلوث باستخدام تقنيات معقم مناسب في جميع الأوقات أثناء إعداد.
  2. زراعة خلايا في المتوسط ​​كاملة (DMEM مع مصل العجل 10٪، الجلوتامين 1٪، 1٪ HEPES و 1٪ البيروفات الصوديوم، انظر الجدول الكواشف محددة أدناه)، على 37 درجة مئوية مع 7٪ CO 2، مع الحرص على ان يكون لها في شبه متموجة، النمو الهائل قبل نشرها في مختبر تيك.
  3. في اليوم قبل التجربة، نشر 5000 خلية / جيدا في 8 جيد تشامبرز (لاب تيك)، واحتضان بين عشية وضحاها. عد الخلايا يضمن كثافة الخلية مستمر، وبالتالي نسبة استنساخه من الكم نقطة لكل خلية.

2. خلية وصفها

إعداد الكم النقاط مع طلاء محددة. الكم نقاط هي جزيئات الفلورسنت يتكون من أشباه الموصلات. هذه الجسيمات النانوية تقدم فائدة مرتفعة لأنها مشرقة جدا وصامد للضوء مقارنة مع الكلاسيكيةفلوري تحقيقات 31،32، والذي يسمح بتحقيق إشارة مناسبة لنسبة الضوضاء (SNR) للتصوير جزيء واحد.

  1. قبل هذه التجربة، وانتاج أجزاء فاب ضد EGFR من خط خلية ورم هجين (ماب 108، ATCC HB-9764)، عن طريق الهضم مع غراء كما هو موضح سابقا 21.
  2. المتقارن فاب مع البيوتين، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (EZ-رابط سلفو-NHS-LC-biotinylation كيت؛ الحرارية العلمية، الشكل 1A).
  3. استخدم الكم النقاط functionalized مع streptavidin (إينفيتروجن)، والتي ينبعث منها عند 605 نيوتن متر (الطول الموجي الأمثل للكشف عن الانبعاثات، والانفصال عن تألق تألق ذاتي الخلوية).
  4. إعداد الحل في وضع العلامات المتوسطة كاملة (انظر الجدول الكواشف محددة)، وذلك لتشبع streptavidins الحالي حول نقاط الكم، وكذلك لمنع تجميع وغير محددة وملزمة للخلايا، وإلى ساترة.
  5. إعداد حلين المتوسطة:واحد مع الكم streptavidin-النقاط وآخر واحد مع فاب المعقدة البيروكسيديز، كل في 20 نانومتر.
  6. مزيج حجم مساو من هذين الحلين: خلط بين النقاط الكمومية مع فاب في نسبة 1:1 للحصول على تركيز العمل النهائية من فاب 10 نانومتر: الكم النقاط المعقدة. باستخدام نسبة متساوي المولية يفضل تشكيل أحادية functionalized المجمعات واحدة مؤلفة من الكم نقطة واحدة جزء فاب المعقدة البيروكسيديز. هذا يفضل وضع العلامات الأحادي التكافؤ، والحد من الملاحظات قطعة أثرية يرجع إلى مستقبلات عبر ربط 33،34.
  7. احتضان لمدة 15 دقيقة في 25 درجة مئوية، وذلك باستخدام شاكر في 1200 التناوب في الدقيقة الواحدة لمنع تجميع. هذا المزيج هو بعد ذلك جاهزة للاستخدام في الخلايا الحية.
  8. احتضان خلايا في 100 ميكروليتر من المزيج لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 7٪ CO 2.
  9. غسل الخلايا المتوسطة مع التصوير غير autofluorescent (HBSS العازلة، HEPES 1٪، انظر الجدول الكواشف محددة) مسبقا على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  10. إزالة بعناية والفائض من التسميات لمنع الأمم المتحدةمن الضروري إفشال SNR بواسطة غير منضم، من التركيز الكم النقاط، عن طريق الغسيل على نطاق واسع مع كل بئر المتوسطة والتصوير، وعادة 5 مرات في درجة حرارة الغرفة، مع ما لا يقل عن 5 دقائق التأخير قبل أن يغسل الماضي.

3. بصري الإعداد

ويتألف الإعداد الفيديو المجهر من أربعة أجزاء رئيسية، هي:

  1. مجهر مقلوب مع مكعب ومضان محددة (FF01-457/50 الإثارة، مزدوج اللون FF495-Di02، وعوامل الانبعاثات FF01-617/73، Semrock) وفتحة عالية العددية (1.3 أو 1.49) للنفط غمر هدف 100X.
  2. A 100 واط زئبق مصباح (بالإضافة إلى المجهر من خلال الألياف البصرية، وتجنب التدخل في التنظيم الحراري).
  3. EMCCD 512 ألف حساسية X 512 بكسل كاميرا عالية لتحقيق SNR كاف.
  4. حاضنة للحفاظ على العينات البيولوجية في 37 درجة مئوية خلال التجربة.

4. اكتساب

  1. تحديد الخلايا المعزولة وكذلك الانتشار. هذاوتؤيد تمديد lamellipodia، لطيف شقة، وتكييفها أفضل للبحث عن حركة مستو من جزيئات الغشاء.
  2. تقييم الوضع الخلوية الفسيولوجية من خلال مظهرها على حد سواء في ضوء المنقولة ومضان: كثافة حركة المرور حويصلي، عدم وجود علامات أو نخرية أفكارك، تألق ذاتي منخفض ومتوسط ​​قوامها الكم دوت وضع العلامات (عادة ما يصل إلى 1،000 الكم نقطة في الخلية، انظر الشكل 1B، C).
  3. تحديد كثافة العلامات العالية، وهو أمر حاسم لرصد في الوقت نفسه مستقبلات أكبر عدد ممكن. ويقتصر في الواقع على حد سواء من قبل هذا الفسيولوجية (تعبير سطح، وسهولة الوصول حاتمة والحركة الجانبية) والمعلمات حسابي (غير المتداخلة نقطة الانتشار وظائف (PSF)، حتى مع الأخذ في الاعتبار عدم وضوح نتيجة للحركة، للسماح للكشف السليم وإعادة الاتصال).
  4. لكل خلية، والحصول على أول صورة مجال brightfield (باستخدام تفضيلي مدينة دبي للإنترنت، إن وجدت) التي يمكن أن تسمح أيضا التحقق من وجود الجانب الخليةوالحدود المكانية للlamellipodia.
  5. حفظ هذه الصورة باستخدام نفس اسم المكدس الفيديو (مثل cell1.tif cell1.stk وعلى سبيل المثال)، في مجلد فرعي باسم مدينة دبي للإنترنت، لأنه، مع هذه الاتفاقيات، ويمكن العثور على خوارزمية تلقائيا مرة أخرى في صورة مطابقة لل كل المكدس.
  6. اكتساب 1-3 أشرطة الفيديو في الخلية، بشكل مستمر، وعادة في 36-MS معدل، وهو أسرع معدل للتحقيق في الإطار الكامل مع هذه الكاميرا. لكن يمكن للمرء الحصول على ترددات أعلى، وتصل إلى 1-MS معدل، وذلك باستخدام CCD مخصصة مع زيادة الحساسية وبكسل / أو أقل. هذه التكنولوجيا توفر الإطار نقل تأخير لا يذكر بين الأطر.
  7. وينبغي دائما الإلكترون تعزيز تتضاعف توضع في الحد الأقصى (أقل بقليل من التشبع، وإذا كان ذلك مناسبا) للسماح تصل إلى واحد جزيء حساسية، مع SNR كاف، على الأقل أكثر من 20 ديسيبل (للكشف عن ذروة الكفاءة 1)، وعادة حوالي 25-30 ديسيبل.
  8. اكتساب عادة 300 لقطة في الخطيئة، والفيديووإعادة بناء مسارات م فوق إطارات 100 ~ في المتوسط، وتقتصر في معظمها من قبل أحداث امض طويل. ويمكن تكييف تردد الفيديو وطول لتدبير ما، مما قد يتطلب فترة أطول آثار على سبيل المثال.

5. MTT التحليل

  1. حدد المسار إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات الفيديو لتقييم مجموعة بيانات معينة مع مطلب أو أوكتاف.
  2. لبدء تحليل automatized 1،35 تماما، اكتب الأمر detect_reconnex23 في أوكتاف، أو MTT23i في Matlab. هذا البرنامج لتقف على "الإصدار 2.3، مع واجهة المستخدم"، ويتوفر للتحميل، جنبا إلى جنب مع الإصدار السابق 2.2. فإنه يعرض لأول مرة الرسوم البيانية واجهة تسرد كل المقاييس المستخدمة، كما هو مبين في الشكل. 2.

6. ممثل النتائج

MTT يحلل تلقائيا في كل فيديو مسجل، لتسليم اثار الكشف عن أهداف ويقدر، وتستكمل كذلك فيvestigations، مثل الكشف عن الحبس. وهذا ما يسمح في النهاية آثار رسم الخرائط على الصور الخلية (الشكل 1C و 3).

MTT الوصف

يتم تنفيذ تحليل MTT الأساسية على كل إطار، استدعاء 3 مهام رئيسية (الشكل 3):

  1. الكشف عن وجود أو عدم وجود الهدف (الكم نقطة)، ضمن المنطقة الفرعية تمحورت حول كل بكسل على التوالي، حيث تتم مقارنة اثنين من الفرضيات انزلاق: وجود أي إشارة، مع قوات الأمن الفلسطينية modelized باعتبارها ذروة التمويه ثنائي الأبعاد ، أو الضوضاء فقط، وذلك باستخدام عتبة تأمين انذار كاذب منخفض بما فيه الكفاية، مع أقل من واحد في إطار كشف زائفة. وهذا يؤدي إلى خريطة من احتمال كشف. ويعتبر كل أقصى المحلية كهدف المفترضة، أن تأمين مستوى الاحتمال هو أعلى من قيمة الحد الأدنى، مجموعة وفقا لنظرية الاحتمالات المرجوة من انذار كاذب (منهاج العمل). تم تعيين هذا الحد منخفض بما فيه الكفاية لتميز بكفاءة SIGnals من الضوضاء، وتجنب في المكتشفة أفضل زائفة (منهاج العمل من 10 -6 افتراضيا، لضمان أقل من واحد خطأ في الصور 512 × 512 بكسل)، في حين لا يزال يسمح وجود احتمال كبير بما فيه الكفاية للكشف، ووصلت إلى 1 تنبأ نظريا الأمثل. لاحظ أن شرط استخدام المنطقة الفرعية يعني أنه لا يمكن أن حدود الصورة (3 بكسل، عن الإطار الافتراضي من 7 بكسل 7 ×) يتم تقييمها.
  2. تقدير، من أجل الكشف عن كل هدف، من المعلمات ذات الصلة، مثل الفرعي بكسل موقف وكثافة الإشارة. مقابل كل هدف الكشف، يتم تنفيذ المقبل على الأقل على مساحة غاوس، نيوتن مناسبا لتقدير الموقف، والعرض والارتفاع للتمويه الكشف عنها. وهذا يوفر لاسيما موقف الفرعي بكسل للصباغة (10 إلى 20 دقة نانومتر للقيم SNR نموذجي وملونات غير متحرك أو نشرها ببطء، وزيادة تصل إلى 100 ​​نانومتر ~ لنزع فتيل الأصباغ عند 0.1 ميكرون 2 / ق).
  3. إعادة ربط أهداف جديدة معآثار بنيت بالفعل على الأطر السابقة. يتم مطابقة مجموعة من الأهداف الجديدة مع مجموعة من الآثار السابقة. لهذا الغرض، من أجل تعيين كل هدف إلى أثر، إذا كان ذلك ممكنا، يتم استخدام جميع المعلومات المتاحة الإحصائية التي تم الحصول عليها من الخطوة الكشف، وليس فقط موقف، ولكن كثافة أيضا، عرض، وامض والاحصاءات ذات الصلة. وبالتالي، لا يتم تعيين أهداف فقط إلى أقرب التتبع: في حالة وجود آثار عبور، وكثافة وسرعة والعرض وامض وسيتم النظر فيها. هذا يسلم النتيجة المثلى لإعادة الاتصال إحصائيا. يتجنب هذه الاستراتيجية، عندما يكون ذلك ممكنا، يتحامل اعادة ربط نحو أقرب الجيران.

يمكن أن يكون الكشف عن قمم لاحقة إذا رفض تقدير، أو إعادة الاتصال فشل. وهناك اختبار خاص يعالج الكشف عن قمم جديدة، والتي من شأنها أن تبدأ آثار جديدة. هذا الاختبار يستخدم PFA أكثر صرامة (10 -7)، منذ إعادة ربط ذروة إلى أثر يمكن أن يفسر في الواقع بمثابة س التحقق من صحة و لها علاقة (وهذا معيار الوجود عن طريق تعريف لا ينطبق على قمم جديدة).

مسار التحليل

ويتم تقييم التالي الحبس عابر ممكن من قبل وظيفة عكسيا مع نشر المحلية 24-29. تطبيق عتبة يسمح لتحديد أم لا تقتصر الحلقات. بواسطة هذه بالتكرار عبر كل آثار، ويمكننا رسم خريطة ديناميات غشاء، من حيث حبس عابر / تبطئ الأحداث. ويمكن هذا يمثل بدلا من ذلك باستخدام إما ثنائي أو قيم منفصلة من هذا مؤشر الحبس.

افتراضيا، MTT تلقائيا تنفيذ تلك المهام، وتوفير 8 معلمات الذروة في ملف نصي: رقم الإطار، i و j الموقف، وكثافة الإشارة، ونصف قطرها، ويقابل وميض، لكل إطار الفيديو (مجموعة من 7 صفوف) وأثر (العمود) . يمكن إعادة هذه معلمات الإخراج في Matlab أوكتاف أو باستخدام البرنامج النصي fread_data_spt لتحليل مزيد من آثار أي إشارة أو شدة، كما حدث مثلا في "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt" سيناريو MTT_example> في التذييل.

المزيد من التحليلات أن يؤدي إلى آثار على تعيين كل خلية (الشكل 1C و 3)، وتوفير توزيع الرسم البياني للمعلمات ذات الصلة (مثل كثافة الذروة، ودائرة الاستخبارات الوطنية أو القيم نشر محلية). لكل ملف، ويتم حفظها يعني الانحراف المعياري لكل معلمة في ملف نصي، جنبا إلى جنب مع صورة من رسوم بيانية. توزيعات لوغاريتمي، مثل لتشريد مربع آر 2، تؤدي إلى المتوسط ​​الهندسي. يتم حساب معامل الانتشار D من نوبة خطي حول النقاط الخمس الأولى من منحنى MSD. هذه القيم لمحة عامة عن التجربة التي تنطوي على سبيل المثال لحركية التفاعلات الخلوية أو العلاجات الدوائية / الأنزيمية التي تؤثر على غشاء منظمة. منذ MTT هو رمز المصدر المفتوح، قد يكون هذا الجانب تتكيف بسهولة إلى أي تحقيق مخصص.

599fig1.jpg "ALT =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. مراقبة ديناميات غشاء المستقبلات بواسطة MTT. مكونات غشاء (A)، مثل EGFR، والموسومة ب الكم النقاط بالإضافة إلى شظايا فاب المعقدة البيروكسيديز (الرسم التخطيطي مع التحجيم الصحيح تقريبا من كل جزيء). (ب) صورة فلوري نموذجي تم الحصول عليها من خلية حية COS-7، مع مرور الوقت تعرض 36 مللي، والتي تصور الحيود محدودة قمم المقابلة لمستقبلات المسمى بشكل فردي. (ج) الناتج من التحليل MTT عرض مسارات المعاد من المستقبلات، مضافين على الصورة brightfield للخلية.

الشكل 2
الشكل 2. معلمات الإدخال MTT. تشغيل MTT23i يفتح واجهة المستخدم الرسومية تسرد كل معلمات الإدخال والأسماء والقيم الافتراضية، كما هو موضح في نشر رسائلنا السابقة 1. في معلمات الخوارزمية، الزمان والمكان (البحث في Windows، دائرة نصف قطرها الذروة، ونشر الحد الأقصى وامض) في بكسل، الوحدات القياسية أبعاد وأطر. ويمكن تطبيق المعايرة لاحقة لتحويل نتائج الإخراج. القيم الافتراضية، المقابلة ل512BFT تتالي مع التكبير 100X، وحجم البكسل: 156 نيوتن متر / pxl وتأخير الإطار: 36 مللي ثانية / الإطار.

وينبغي أن المحققين تحسين عدد قليل من المعالم الهامة، مثل معامل الحد الأقصى المتوقع نشر ("الفرق ماكس") واختفاء امض الأقصى ("T OFF"). هذين المكان والزمان حدود تكاد تكون الوحيدة التي تحتاج إلى أن يعاد النظر عن حالة تجريبية معينة، يجري تعيين آخرين إلى القيم الافتراضية قوي. على سبيل المثال، يتم تعيين بشكل مباشر على عدد من الانذارات الكاذبة لضمان أقل من واحد خطأ لكل مليون بكسل، وبالتالي أقل من واحد في إطار، والتي هي حالة مرضية في معظم الحالات. ويتم حفظ جميع المعلمات في ملف نصي في المجلد الإخراج، مما يسمح للمستخدمين التحقق من بعد ذلك الإعدادات التي كانت تستخدم للتحليل.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "ALT =" شكل 3 "/>
الشكل 3. الخطوات الرئيسية لتحليل MTT. ابتداء من 1 مكدس التجريبية من الصور مضان، وبالتسلسل وتلقائيا الكشف عن القمم والتي تقدر من قبل نوبة التمويه وإعادة الاتصال على الإطارات (النطاق الأول للعمليات، والجزء العلوي من المخطط الانسيابي). ويمكن أيضا أن تحلل آثار للحبس المفترضة، على سبيل المثال، مما يؤدي في النهاية إلى خريطة ديناميكية واصفات ذات الصلة (مجموعة الثانية من العمليات، والجزء السفلي).

الشكل 4
الشكل 4. وتكافؤ وضع العلامات لا يؤثر MTT. لتقييم احتمال تحيز التي أدخلها وضع العلامات متعددي مصطنع، يقوم MTT تحليل لتعقب EGFR الذاتية الموسومة باستخدام 2 مخططات مختلفة، لتوليد وتحليل خرائط للمسارات. (A) والموسومة المستقبلات مع فاب المعقدة البيروكسيديز والكم dots605 streptavidin، كما هو موضح في البروتوكول.في هذه الحالة، قد تكافؤ متعددة من الكم النقاط وstreptavidins يؤدي إلى اقتران مستقبلات عدة إلى صبغة واحدة. (ب) والموسومة المستقبلات مع فاب يقترن مباشرة إلى الصبغة العضوية، Atto647N. في هذه الحالة، يمكن أن يقترن 1 فاب، وبالتالي 1 المستقبلة، إلى أكثر من صبغ. (ج) تم حساب متوسط ​​مربع الإزاحة (MSD) لمنحنى كل آثار لكل خلية، وصفت إما مع الكم نقطة أو الأصباغ عطو (الرسوم البيانية اليسار واليمين، على التوالي). تم حساب معاملات نشر بواسطة صالح خطي حول النقاط الخمس الأولى من (الخط المنقط باللون الأحمر) MSD. كل مخطط وصفها أدت إلى نشر قيم مماثلة (الرسم البياني المركزية). Qdot: الكم dots605 (ن = 5 الخلايا)، عطو: Atto647N (ن = 7 الخلايا)، NS: لم تكن كبيرة (القيمة الطالب ف اختبار t> 0.05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في واحدة تتبع الجسيمات، بجانب الجوانب الخلية والمجهري، وتحليل يمثل جزءا كبيرا من العمل. هذا ويتناول الخوارزمية المستخدمة لتنفيذ المهام الرئيسية الثلاث: كشف وتقدير وإعادة قمم فوق كل إطار. لكن الجانب يترتب على ذلك من هذا العمل تكمن في وضع الخوارزمية نفسها، والتي قد تحتاج إلى أن تتكيف لتحقيق أي مخصص جديد، وذلك أساسا للخطوات، مشاركة إضافية (مثل فك رموز وسائل الحركة، والتفاعل أو رياضيات الكيمياء).

ومع ذلك، بمجرد أن يتم تطويره بالكامل الخوارزمية، تشغيله واضحة ومباشرة، خصوصا اننا الاهتمام في الحفاظ على عدد من معلمات الإدخال في الحد الأدنى (الشكل 3). هذا يجعل MTT قوية جدا وسهلة التنفيذ. تهدف نحن عندما وضع MTT، في إعادة النظر كليا في الخيارات التحليلية المستخدمة لكل مهمة. أردنا أن تحسين عملية على محورين التحدي:

  1. تعامل الطرافةح كثافة عالية من وضع العلامات ويوفر معلومات مفصلة في المدى المكاني لأخذ العينات سطح الخلية. من الناحية المثالية، واحد في محاولة لتتبع عدد سكانها ما يقرب من كامل الجزيئية في وقت واحد، من أجل الحصول على رصد شامل. ومع ذلك، فإن وضع العلامات شاملة تؤدي هذه إلى صورة مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بواسطة كلاسيكي المناعي، من دون واحدة جزيء القرار، حيث أن جميع تسميات تتداخل بقوة بسبب الحيود. لعدد الجزيئية نموذجي (أي ~ 10 5 بواسطة مستقبلات الخلية 30) وحجم الخلية (أي ~ 30 ميكرون)، لو افترضنا توزيع متجانس، ومتوسط ​​المسافة بين جزيء هو ~ 100 نانومتر. نشر خلال اكتساب يساهم أيضا في نشر قوات الأمن الفلسطينية إلى حد مشابه: عادة ~ 100 نانومتر عن الحركة البراونية عند 0.1 ميكرون 2 / ق لمدة 30 مللي. الجدير بالذكر أن هذا الانتشار غير موحد الخواص في المتوسط، وبالتالي يولد تزال قوات الأمن الفلسطينية التمويه مثل. ومن هنا يمكن أن تصل إلى 10٪ من السكان الكشف نظريا، لأن من شأن هذا لياد لمسافة ميل بحري في المتوسط ​​300 ~، متوافقة مع حدود الحيود والحركة. ومع ذلك، هذا يجب أن يكون عن طريق التضمين المحاسبة عن عدم التجانس في التوزيع المكاني، واصفة القيود (مثل القيود الفراغية، وسهولة الوصول حاتمة، الخ)، وزيادة الصراعات وحتى غير قابلة للحل نظرا لمسارات عبور، والكفاءة الكلية للكشف. تجريبيا، يمكن أن نصل إلى وترصد بدقة، جزءا مهما من إجمالي عدد السكان، مع كثافة من تسميات 1000 ~ داخل مجال الرؤية من عرض ميكرون 80. هذه النتائج الحد الأعلى من حلا وسطا بين الحاجة الى اكتشافات الفردية والهدف من قياس 1 المكانية شاملة (انظر الشكل 1C لتقدير المكاني لأخذ العينات من سطح الخلية).
  2. التعامل مع SNR أضعف ممكن يسمح التصوير إما في إضاءة منخفضة، والذي هو مفيد ل/ خلايا البقاء و، أو في سرعة عالية، والذي يوفر معلومات أفضل الزمنية. ومع ذلك، وهذا يعني انخفاض إشاراتلكل صورة، وذلك بسبب انخفاض عدد الفوتونات التي تم جمعها. لاحظ أن أقصر توقيت يمكن تحقيقه بواسطة الكاميرات EMCCD (1 مللي) ويبدو أن تتوافق مع SNR أدنى مقبول (20 ديسيبل) للكشف عن المناسبة وتقدير من قبل MTT.

وصفها تكافؤ مسألة متكررة في دراسات جزيء واحد. في الواقع، مقياسا مباشرا لنسبة صبغ / الهدف التي تشكل تحديا كبيرا 34. ومع ذلك، وسيلة بديلة للتحري عن التحيز المفترضة التي أدخلها وضع العلامات متعددي مصطنع يتمثل في مقارنة مع تدابير به الكم دوت إما (مع عدة أهداف مزعومة في صبغ، الأمر الذي أدى يشابك مصطنع) أو صبغ به العضوية (مع، على العكس من ذلك، الأصباغ عدة مزعومة لكل هدف، يتحامل فقط كثافة إشارة وتبيض الخصائص). لاحظنا وغيرها 6،36،37 سلوك مماثل عندما باستخدام الكم النقاط أو الأصباغ العضوية (atto647N في حالتنا، الشكل 4)، من حيث الانتشار والانتقال بين موقصر للحركة. الاختلاف في القيم بين نشر الشرطين هو أقل من التفاوت خلية الى خلية (الشكل 4C). وهذا يدل على أن تكافؤ وضع العلامات، حتى ولو لم يكن التكافؤ بشكل صارم، لا يؤثر بشكل كبير على النتائج SPT.

الحبس والتفاعلات الجزيئية

ويمكن تفسير الحبس عابرة أو مستقرة كما توقيع تقارب تفضيلية أو التفاعل 24-29. Biomembranes هي في الواقع غير متجانسة بقوة، مع المجالس المحلية التي تمليها السمات الهيكلية مثل hydrophobicity، حجم عبر الغشاء والتوتر بينية. هذه القوى الدافعة يؤدي إلى إعادة عرض المكانية من الجمعيات الفنية مع الأدوار الحاسمة للإشارة أي التصاق أو الاتجار بها. ومن المتوقع تعيين وقياس مثل هذه الأحداث لتوفير مفتاح فك كيف يمكن لخلية يدمج المحفزات المقدمة بشكل مستمر. في الواقع، لخلية، واظهار للتكيف مناسب من خلال REQ استجابة دقيقةuires ضبط التفاعلات بين الشركاء في إشارة وبيئتهم. قد مستقبلات غشاء التفاعل سواء مع الأسوار الهيكل الخلوي شبه غشاء، والهياكل غشاء مثل حفر التقامي أو الالتصاقات البؤرية، أو أيضا شركاء بروتيني / الدهون، والمشاركة في المجالات مما يشير على سبيل المثال. في التمثيل لدينا، يمكن أن يتم التحقيق في مثل هذه الأحداث من خلال قوة الحبس والاختلافات على مدى الزمان والمكان. وتعزز هذه المبادرة على أهمية العمل في هذا القرار الفضاء في الوقت أعلى للتحقيق، مع الأخذ في الاعتبار القيود المرتبطة إلى أوقات قصيرة وكثافة عالية، كما نوقشت أعلاه.

تقنيات تكميلية

وهو ممارسة جيدة لمقارنة القياسات الحيوية مثل مع المناهج الأخرى. لغيرها من تقنيات الفحص المجهري سبيل المثال الحيوية، مثل FRAP والسفح، وتوفير حساسية التكميلية وقرار 4،38،39. FRAP يوفر قياس الفرقة من الانتشار الجزيئي، في حين يمكن أن تصل إلى السفح قإنجل جزيء حساسية، مع قرار قتا طيبا جدا. ومع ذلك، وتقتصر في جوهرها على حد سواء أساليب لقياس المحلية (عادة ضمن بقعة مبائر). هذا دفعنا للاستفادة ودفع حدود الإمكانيات المكانية لSPT: التحقيق في حقل كبير للعرض، ليشمل كل خلية في آن واحد، مع دقة 1 المكانية ذات الصلة محليا

مزيد من التطورات والتحقيقات

وفقا لمجموعة من الأسئلة الحيوية التي يمكن معالجتها باستخدام واحدة جزيء القياسات، يمكن توسيع MTT على طول مختلف الاتجاهات، على كل مستوى: الكشف وتقدير، وإعادة ربط المزيد من التحليلات. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يفكر في التعامل مع أكثر من سكان الجزيئية، داعيا الى كشف متعدد الألوان - كما يمكن القيام بها باستخدام برامج مخصصة البصرية أو تحليلي. ويمكن تقدير تشمل اصفات الجديدة ذات الصلة، مثل أي الطيفية أو معلومات الاستقطاب، أو محوري فيض الموقف، لتوسيع نطاق البحث عن المفقودين في 3D 40.

لإعادة الاتصال، ويمكن للافتراضات البراونية وامض إعادة النظر بشكل كامل لمشكلة معينة. وقد تم تمديد ومن المثير للاهتمام، واحدة جزيء القياسات على مدى العقد الماضي إلى نظام يسمى نانوية 17،22،23. على الرغم من أن MTT تعالج مباشرة واحدة جزيء التوطين، فإنه من الأهمية الحاسمة للنظر في حالة وجود نموذج ثابت، والذي يوفر حلا آمنا لتوطين شاملة للسكان الجزيئية. ومع ذلك، في مثل هذه الحالة، فإن الافتراض البراونية لم يعد صالحا. الاستعاضة عنها بدقة التعامل مع مقياس نانوية، وقلة فقط من قبل دائرة الاستخبارات الوطنية، أمر بالغ الأهمية للوصول إلى أفضل قرار النانومترية.

على طول هذه التطورات، على أساس إما 3D، متعدد الألوان و / أو تدابير شاملة، ومن المتوقع أن عمل في المستقبل لتقديم نظرة شاملة عن البيانات الجزيئية والدينامية. وسيكون لذلك relev مباشرةتعصب للدراسات بيولوجيا الخلية، مثل فك رموز الإشارات التي تنظم طرائق خفية من خارج وداخل الخلايا.

تحميله MTT

شفرة المصدر من MTT هو متاح في برمجيات المصدر المفتوح للبحوث العلمية. ويمكن تحميلها من صفحة الويب لدينا، في ciml.univ-mrs.fr ، قبل الانتقال إلى صفحة فريق العمل لدينا، وقال انه ومختبر Marguet، التي تنص على وجود صلة لوصف البرامج والتحميل. يرجى ملاحظة أن نطلب منك اسمك والمؤسسة الوحيدة للحصول على المعلومات، على سبيل المثال في حالة وجود مزيد من التعاون أو أن أبلغكم عن إصدار جديد أو تحديث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن نشكر أعضاء فريق العمل لدينا، Blache MC خاصة لتقديم المساعدة التقنية، وكذلك M Irla Imhof وباء، ولما قدموه من دعم ومناقشات مثمرة. استنساخ الأرقام لالانكماش والحبس مجاملة من طرق الطبيعة. هذا المشروع يتم بدعم من المنح المقدمة من المؤسسات CNRS، INSERM وجامعة مرسيليا، ومنح محددة من منطقة بروفانس ألب كوت--d'Azur، المعهد الوطني للسرطان دو، الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-PCVI-08- 0034-02، ANR بلان 2010 1214 01) ومؤسسة بور لا بحوث ميديكال (إيكيب labélisée FRM-2009). ويدعم VR من قبل زمالة من السرطان الوطني الفرنسي جنيه كونتر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cos-7 cell line ATCC CRL-1651 5,000 cells/well
HBSS without Ca2+ GIBCO, by Life Technologies 14175 1 ml
0.05% Trypsin EDTA GIBCO, by Life Technologies 25300 1 ml
8-well Lab-tek Nalge Nunc international 155441 1
QDot-605 streptavidin Invitrogen Q10101MP 20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108 ATCC HB-9764 200 μg
NHS-Biotin Thermo Fisher Scientific, Inc. 21435 18.5 μg
Complete medium
DMEM GIBCO, by Life Technologies 41965 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524 50 ml
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 5 ml
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630 5 ml
Sodium Pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360 5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+ GIBCO, by Life Technologies 14025 25 ml
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630 250 μl
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp Nikon Instruments Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective Nikon Instruments Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective Nikon Instruments APO TIRF 1.49
Camera Roper Scientific Cascade 512 B
Thermostated box Life Imaging Services The Box
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided?
files = dir('*.stk');
if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end
file_name = files(1).name; % default: first stk file
disp(['using' file_name 'by default'])
end
file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file
%% Load data
 cd('output23') % or (‘output22'), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ...
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces
No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)')
title(['trace # ' num2str(itrc)])
disp('Please strike any key for next trace'), pause
end
%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence')
title('histogram of particles fluorescence intensity')

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
  3. Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
  4. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
  5. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
  6. Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  7. Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
  8. Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
  9. Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
  10. Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
  11. Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
  12. Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
  13. Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
  14. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  15. Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
  16. Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
  17. Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
  18. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  19. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  20. Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
  21. Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
  22. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
  23. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
  24. Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
  25. Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
  26. Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
  27. Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
  28. Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
  29. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
  30. Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
  31. Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
  32. Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
  33. Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
  34. Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
  35. Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
  36. Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
  37. Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  38. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
  39. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
  40. Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).

Tags

الفيزياء، العدد 63، واحدة تتبع الجسيمات، واحدة جزيء مضان المجهري، وتحليل الصور، وتتبع خوارزمية، عالية الدقة خريطة الانتشار، والبلازما منظمة غشاء الوحشي
رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rouger, V., Bertaux, N., Trombik,… More

Rouger, V., Bertaux, N., Trombik, T., Mailfert, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Sergé, A. Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT). J. Vis. Exp. (63), e3599, doi:10.3791/3599 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter